特定基因突變可能會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特殊行為，例如超強耐藥性等。在活細(xì)胞內(nèi)、單細(xì)胞水平上探索基因突變與活細(xì)胞行為相關(guān)性能夠為臨床治療提供更加精準(zhǔn)可靠的參考。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近日，北京航空航天大學(xué)常凌乾課題組在著名期刊Nano Letters上發(fā)表了一篇名為“Single Living Cell Analysis Nano-platform for High-throughput Interrogation of Gene Mutation and Cellular Behavior”的研究論文，并被選為當(dāng)期的內(nèi)封面文章。該課題組開發(fā)了一種新型活細(xì)胞陣列研究平臺，通過納米電遞送技術(shù)將一種可原位信號放大的Domino熒光探針高效地遞送至活細(xì)胞內(nèi)，在單細(xì)胞水平檢測細(xì)胞內(nèi)基因突變。同時，基于微孔陣列的納米芯片具備細(xì)胞尋址的功能，可實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的原位分析（圖1）。在研究臨床肺癌細(xì)胞樣本時發(fā)現(xiàn)，肺癌某些基因突變細(xì)胞比例與細(xì)胞對靶向藥敏感程度呈現(xiàn)正相關(guān)性。此平臺為單細(xì)胞分析、胞內(nèi)基因檢測提供了一種通用方法，在指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)治療方面具有較大的應(yīng)用潛力。

圖1 單細(xì)胞分析納米平臺原理示意圖。（a）基于微孔陣列的納米芯片在單個活細(xì)胞中檢測靶標(biāo)RNA的原理。（b）Domino探針與靶標(biāo)RNA結(jié)合前（OFF）后（ON）的構(gòu)象變化示意圖。（c）納米芯片用于將Domino探針遞送到活細(xì)胞中，并提供每個細(xì)胞的位置信息。（d）芯片分層裝配示意圖。

EGFR突變在肺癌基因突變中存在率最高。盡管EGFR靶向藥物可有效延長患者存活期，但腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性，造成靶向藥物失效。預(yù)測患者是否存在EGFR突變，并推斷其腫瘤細(xì)胞對靶向藥物的耐藥性，在提高肺癌治療效果中起著關(guān)鍵作用。作者設(shè)計了一種名為“Domino”的DNA探針。此探針利用堿基互補配對原則，通過將成對的發(fā)夾DNA序列組裝形成緊密的螺旋鏈。與傳統(tǒng)的分子信標(biāo)相比，Domino探針被靶標(biāo)RNA識別的反應(yīng)速度加快了4倍，熒光信號增強了10倍。為遞送此探針，該論文作者開發(fā)了一種納米孔電遞送芯片，將Domino探針遞送到位于可尋址微孔中的數(shù)百萬個的肺癌細(xì)胞中，實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的EGFR基因突變檢測（圖2）。

圖2 納米平臺檢測細(xì)胞內(nèi)的基因突變。（a）微孔陣列靶向L858R突變的Domino探針檢測H1975細(xì)胞（EGFR L858R突變）。比例尺：50 μm。（b）納米平臺檢測肺癌細(xì)胞H1975（L858R突變），HCC827（19外顯子缺失突變）和A549（野生型）EGFR L858R和19外顯子缺失突變的熒光圖。比例尺：10 μm。（c），（d）和（e）納米平臺檢測肺癌細(xì)胞H1975（c），HCC827（d）和A549（e）EGFR L858R和19外顯子缺失突變的流式結(jié)果。（f）采用流式細(xì)胞儀檢測的H1975，HCC827和A549細(xì)胞的突變細(xì)胞陽性率。（g）統(tǒng)計微孔陣列上突變細(xì)胞的陽性率。（h）SLCA納米平臺針對H1975，HCC827和A549細(xì)胞的加載效率，遞送效率和細(xì)胞活率。

該論文作者利用該平臺研究了肺癌患者臨床樣品中單個活細(xì)胞的基因突變，揭示了EGFR突變（21外顯子L858R和19外顯子E746-A750缺失突變）與相應(yīng)的靶向藥物耐受性之間存在明顯的正相關(guān)性（圖3）。該工作中提出的納米平臺實現(xiàn)了原位細(xì)胞培養(yǎng)、活細(xì)胞內(nèi)基因探測以及時空可控的細(xì)胞行為分析。

圖3 原代腫瘤細(xì)胞樣品中EGFR RNA突變檢測和耐藥性分析。（a）納米平臺檢測患者L1原代腫瘤細(xì)胞中EGFR L858R突變RNA的熒光圖像。比例尺：100 μm。（b）和（c）采用納米平臺從具有EGFR L858R突變（b）或19外顯子缺失突變（c）的原代腫瘤細(xì)胞樣品中檢測到的突變細(xì)胞陽性率。（d）和（e）分別對EGFR L858R突變（d）或19外顯子缺失突變（e）的原代腫瘤細(xì)胞樣品進行單細(xì)胞基因分析的qPCR結(jié)果。（f）和（g）EGFR突變靶向藥物厄洛替尼和吉非替尼對EGFR L858R突變（f）或19外顯子缺失突變（g）的原代腫瘤細(xì)胞的抑制作用。

該論文第一/通訊單位為北航生物醫(yī)學(xué)工程高精尖創(chuàng)新中心和生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院。第一作者是董再再博士。北京大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院吳楠教授和首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院薛新穎教授為共同通訊作者。

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