近期，北京理工大學(xué)研究人員開發(fā)了基于LAMP-CRISPR耦合滑動芯片和智能手機(jī)的miRNA檢測系統(tǒng)：“靈捕”。該系統(tǒng)在生物傳感器的基礎(chǔ)上，通過滑動芯片對檢測的各個環(huán)節(jié)進(jìn)行集成，同時利用智能手機(jī)微信小程序?qū)崿F(xiàn)了可視化交互，以及現(xiàn)場快速即時檢測（point-of-care testing，POCT），可應(yīng)用于癌癥早篩。

“靈捕”系統(tǒng)示意圖

結(jié)直腸癌作為一種常見的消化道惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率。隨著社會經(jīng)濟(jì)水平的提高及生活和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國結(jié)直腸癌總體發(fā)病率與死亡率呈現(xiàn)明顯上升趨勢。結(jié)直腸癌患者Ⅳ期5年生存率為8%，而Ⅰ期5年生存率可以達(dá)到87.9%，在患者早期完成結(jié)直腸癌的篩查具有十分重要的意義。

目前臨床采用的篩查方法有胃腸鏡檢查、低劑量CT篩查及糞便隱血試驗(yàn)等，但仍存在臨床檢測成本較高，以及各類并發(fā)癥或機(jī)體損傷的問題，目前臨床普及性較高的癌癥早期篩查手段均具有一定的局限性，迫切需要一種高效、安全的篩查方法。

微小核糖核酸（miRNA）是在進(jìn)化上保守的、由19~22個成熟核苷酸組成的小分子非編碼調(diào)節(jié)單鏈RNA序列。miRNA的功能涉及到各種生理病理過程，在癌癥及相關(guān)癌前病變的不同疾病階段以及不同的發(fā)病部位之間都存在較為顯著的表達(dá)差異，并且已有多種miRNA被證實(shí)是有效的癌癥早篩標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)其檢測意義重大。

miRNA可作為多種癌癥的生物標(biāo)志物 RT-qPCR核酸擴(kuò)增技術(shù)，可以通過復(fù)雜的探針設(shè)計將較短的miRNA序列變成較長的靶標(biāo)，但作為變溫擴(kuò)增方法，需要大型且較為昂貴的熱循環(huán)儀，其在資源有限的環(huán)境中的應(yīng)用受限。在此基礎(chǔ)上，研究人員提出環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（LAMP）以提高序列特異性、簡化擴(kuò)增系統(tǒng)、降低檢測設(shè)備的開發(fā)成本。此外，基于滑動芯片的微流控芯片，具有操作簡便、對操作人員要求不高、所需樣本量少和檢測成本低、微型化、 高效快捷以及容易與其他裝置集成等特點(diǎn)，因此，研究人員構(gòu)建了與LAMP結(jié)合的全集成滑動芯片。

與LAMP結(jié)合的全集成滑動芯片示意圖

目前，miRNA檢測存在用時較長、檢測成本較高、需要設(shè)備較多等問題。miRNA即時檢測（POCT，point-of-care testing）系統(tǒng)，則是一類能夠在采樣現(xiàn)場即刻進(jìn)行分析、省去標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)室檢測時的復(fù)雜處理程序、快速得到檢測結(jié)果的新方法。基于此，研究人員由滑動芯片以及智能手機(jī)共同構(gòu)建了更具環(huán)境部署性與信息關(guān)聯(lián)性的POCT系統(tǒng)，來實(shí)現(xiàn)方便、快捷的miRNA檢測。

“靈捕”系統(tǒng)設(shè)計總方案

“靈捕”系統(tǒng)的優(yōu)勢 生物傳感器的設(shè)計“靈捕”系統(tǒng)充分整合LAMP等溫擴(kuò)增技術(shù)、CRISPR/Cas檢測技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）等診斷學(xué)的新技術(shù)、新方法，通過LAMP實(shí)現(xiàn)miRNA的等溫擴(kuò)增，采用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)特異性識別擴(kuò)增產(chǎn)物并輸出熒光信號，建立熒光強(qiáng)度與miRNA濃度的關(guān)系以實(shí)現(xiàn)定量檢測。

“靈捕”系統(tǒng)生物傳感器設(shè)計

基于生物檢測的硬件設(shè)計

研究人員設(shè)計了滑動芯片用以整合復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室操作，既可以保持LAMP簡便、快捷、高效等優(yōu)點(diǎn)，又能以較少的試劑消耗實(shí)現(xiàn)檢測，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建相應(yīng)的小型化設(shè)備以提供反應(yīng)溫度、檢測熒光結(jié)果。 軟件設(shè)計 “靈捕”系統(tǒng)還搭建了基于智能手機(jī)的小程序平臺，以實(shí)現(xiàn)對設(shè)備的控制及結(jié)果的可視化。使用者在使用時僅需按照微信小程序的操作提示進(jìn)行加樣操作即可完成儀器的使用，可以將反應(yīng)主體部分拉出以進(jìn)行反應(yīng)試劑加樣。

硬件和軟件設(shè)計

微信小程序示例圖 建模流程設(shè)計 建模部分以結(jié)直腸癌為癌癥代表，通過生物信息學(xué)方法，篩選結(jié)直腸癌相關(guān)miRNAs用于檢測方法開發(fā)中檢測對象的確定；并建立綜合風(fēng)險評分模型，基于檢測到的用戶樣本中多種miRNA的含量，綜合評價其患癌風(fēng)險。

建模流程設(shè)計

LAMP-CRISPR反應(yīng)的表征 研究人員首先驗(yàn)證LAMP-CRISPR檢測miRNA的可行性，采用體系終濃度為5pM的miRNA-21進(jìn)行LAMP引物連接反應(yīng)、LAMP擴(kuò)增及CRISPR/Cas12a三步實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)這一檢測原理的可行性。無LAMP擴(kuò)增反應(yīng)證明了LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的必要性：將miRNA轉(zhuǎn)換為CRISPR/Cas12體系可識別的雙鏈結(jié)構(gòu)，并對miRNA信號進(jìn)行放大。

LAMP-CRISPR反應(yīng)的表征 LAMP-CRISPR/Cas體系用于miRNA的定量檢測 為了測試生物傳感系統(tǒng)對miRNA的檢出限，研究人員設(shè)置miRNA濃度梯度為500fM、50fM、5fM、0.5fM、0.05fM，構(gòu)建檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明miRNA的濃度與熒光強(qiáng)度具有線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)93.13%，得出檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線LOD為0.069fM。

miRNA檢出限測定 硬件基礎(chǔ)及配套試劑優(yōu)化 為在滑動芯片上實(shí)現(xiàn)miRNA檢測試劑的預(yù)包埋，研究人員設(shè)計采用凍干珠替代LAMP試劑、CRISPR試劑，并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可行性。在滑動芯片中進(jìn)行單獨(dú)LAMP反應(yīng)和LAMP+CRISPR反應(yīng)，通過熒光顯微鏡觀測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)滑動芯片和溫度控制模塊可以有效實(shí)現(xiàn)LAMP與CRISPR步驟，熒光檢測模塊經(jīng)測試可以正常使用。

熒光顯微鏡下LAMP和LAMP+CRISPR反應(yīng)結(jié)果觀察圖

溫度控制模塊和熒光檢測模塊 總體而言，研究人員構(gòu)建了LAMP-CRISPR技術(shù)耦合滑動芯片及智能手機(jī)的miRNA檢測系統(tǒng)：“靈捕”。檢測系統(tǒng)以miRNA作為癌癥早篩的生物檢測標(biāo)志物，將LAMP等溫擴(kuò)增與CRISPR/Cas12切割技術(shù)二者相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對miRNA信號的高靈敏度擴(kuò)增與識別。同時，研究人員通過滑動芯片實(shí)現(xiàn)了生物檢測體系的集成，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了相應(yīng)的小型化設(shè)備以提供反應(yīng)溫度、檢測熒光結(jié)果。此外，研究人員建立了可支持生物傳感模塊與滑動芯片模塊的智能手機(jī)即時檢測操作系統(tǒng)，保證以可視化的形式呈現(xiàn)檢測結(jié)果、實(shí)現(xiàn)對設(shè)備的控制。

審核編輯 ：李倩