外泌體是一類潛在的生物標志物，在細胞間通訊、疾病診斷和治療中都起著非常重要的作用。為了獲得更準確的外泌體組成成分/異質(zhì)性/功能的信息，并將其實際應用于臨床，近年來科研人員報道了一系列分離外泌體的方法。基于微流控的方法可以操控微米/納米級顆粒和實現(xiàn)高通量分析，東北大學王建華課題組綜述了近幾年基于微流控的外泌體分離方法，包括免疫親和微流控芯片、尺寸介導微流控分離芯片和多方法集成的微流控裝置等，并在此基礎上介紹了將微/納流控與先進的檢測技術(shù)相結(jié)合應用于（單）囊泡水平上外泌體分離分析的方法。此外，該綜述文章還討論了機器學習和智能算法在單外泌體的多維檢測方面的機遇和挑戰(zhàn)。相關(guān)工作以“Microfluidic Strategies for the Isolation and Profiling of Exosomes”為題發(fā)表于Trends inAnalytical Chemistry期刊。

圖1 基于微流控芯片的外泌體分離和單個細胞外囊泡分析的方法

免疫親和微流控分離方法

外泌體包含多種跨膜蛋白（CD63，CD9和CD81等）和生物標志物蛋白（EpCAM，HER2和CA-125等）。因此，基于外泌體表面蛋白和抗體/適配體之間的特異性結(jié)合，可以實現(xiàn)外泌體的免疫親和捕獲。免疫親和微流控分離方法可以分為兩類：（1）抗體/適配體修飾磁珠捕獲體液內(nèi)外泌體；（2）具有抗體/適配體修飾界面的微流控芯片實現(xiàn)外泌體的分離。基于磁珠的微流控芯片可以使用磁鐵將磁珠保留在微流控腔室內(nèi)以同時實現(xiàn)外泌體的免疫親和捕獲和下游分析。通過制備具有多孔表面/微柱的微流控芯片以實現(xiàn)外泌體的高效捕獲，并結(jié)合釋放機制獲得完整的外泌體。綜上，免疫親和微流控方法可以實現(xiàn)外泌體的高純度和高特異性捕獲和分離，但是存在因外泌體異質(zhì)性導致的捕獲效率不高、修飾步驟繁瑣等缺點。

圖2 基于免疫親和微流控的外泌體分離方法

尺寸介導微流控分離方法

尺寸介導的微流控分離方法提供了從小尺寸蛋白質(zhì)和其它大尺寸囊泡中有效分離外泌體和區(qū)分外泌體亞群的機會。該方法包括主動分離和被動分離。主動分離方法通常需要引入外加力場（聲場和電場）來實現(xiàn)外泌體的分離。被動分離則是基于流體動力學達到區(qū)分不同尺寸顆粒的目的。例如，基于確定性側(cè)向位移（DLD），具有納米級孔徑的過濾膜、納米線和粘彈性流體等原理的微流控芯片可以實現(xiàn)生物體液中外泌體的無標記、無外加場分離。

圖3 基于尺寸介導的微流控分離方法

集成微流控分離方法

為了克服上述微流控分離方法所存在的缺點，研究者們嘗試將其中一些方法結(jié)合起來實現(xiàn)外泌體的高效分離。例如，將主動分離方法（電場）與被動分離方法（過濾膜）相結(jié)合實現(xiàn)無標記、操作時間短、回收率高、損傷小等優(yōu)點的外泌體高效分離，并實現(xiàn)下游分析。

圖4 基于尺寸介導的/集成微流控分離方法

單外泌體分離分析方法

外泌體的大小、組成成分、功能和細胞來源各不相同導致其存在強異質(zhì)性。此外，外泌體的異質(zhì)性也可能受到器官和組織起源的影響。因此，在單囊泡水平上了解和分析外泌體的性質(zhì)是非常重要的。但是，大量已報道的方法都是集合分析方法，所獲得的數(shù)據(jù)為外泌體的平均信息，而單個外泌體的信息仍然未知或未被檢測到。因此，迫切需要開發(fā)新的技術(shù)來闡明單個外泌體的組成、功能和異質(zhì)性等。該文介紹了目前已實現(xiàn)單外泌體分析的檢測技術(shù)，包括超分辨顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡、納米等離激元傳感器等，并重點總結(jié)了先進技術(shù)與微/納流控相結(jié)合應用于單外泌體分析的方法。微流控芯片的使用不僅方便于實驗條件的控制，而且減少了樣品需求量。此外，強調(diào)了結(jié)合算法和機器學習的微流控分離分析策略在單個外泌體成像或檢測方面顯示出的巨大潛力。

圖5 單外泌體檢測方法

綜上所述，隨著外泌體在癌癥診斷和治療中的潛力日益增長，開發(fā)一種適用于臨床應用的高效分離外泌體的方法變得越來越重要。微流控技術(shù)由于其易于集成操作、樣品消耗少、高通量等優(yōu)勢，在分離外泌體方面展現(xiàn)出了巨大的前景。作者主要總結(jié)和介紹了用于分離和分析復雜生物樣本中外泌體的微流控芯片；提出了基于微流控的策略有望實現(xiàn)從少量生物體液中分離單個外泌體，并與先進檢測技術(shù)、機器學習和算法相結(jié)合實現(xiàn)單外泌體的多維分析。相關(guān)工作為了解外泌體作用機制提供研究基礎和未來發(fā)展方向，加速了外泌體相關(guān)研究從實驗室走向臨床應用。

審核編輯：郭婷