用SPAD 23在共聚焦顯微鏡中實現(xiàn)波動對比度的超分辨率

在過去的 20 年里，遠場光學顯微鏡已經(jīng)跨越了以阿貝衍射極限為代表的一度難以逾越的分辨率障礙 ，開發(fā)多種成功的方法，如受激發(fā)射損耗(STED) 、單分子定位方法(PALM 和 STORM) ，結(jié)構(gòu)照明顯微術(shù)(SIM)和超分辨率光學波動成像(SOFI)，這要歸功于圖像傳感器技術(shù)的改進以及單分子光譜學的巨大進步。

在這里，我們提出了一種新的顯微技術(shù)，它利用 SPAD23陣列探測器的超高時間分辨率來測量熒光波動引起的相關(guān)性。在 ISM 架構(gòu)中測量的這種相關(guān)性，然后被用作具有高達 4倍增強橫向分辨率和增強軸向分辨率的超分辨率圖像的對比度。僅用幾毫秒的像素駐留時間就可以獲得高信噪比的超分辨率圖像。

單光子探測器陣列SPAD23技術(shù)源于代爾夫特理工大學和洛桑聯(lián)邦理工學院 7 年的研究工作和 6 項獨特技術(shù)。它是由23個六角形封裝的單光子雪崩二極管組成的探測器陣列(SPADs)，具有更高的靈敏度和更低的噪聲。這款單光子探測器陣列SPAD23在其寬探測譜段內(nèi)擁有>50%的探測效率，<100cps的暗計數(shù)水平，且因其獨特的半導(dǎo)體工藝及設(shè)計實現(xiàn)了前所未有的填充因子＞80%。這款帶有時間標記功能（Time Tagging）的SPAD23整體尺寸只有信用卡大小，是熒光顯微和量子信息領(lǐng)域的理想探測工具。

得益于SPAD23單光子陣列探測器的優(yōu)異性能，在與共聚焦顯微鏡搭配使用的過程中，增加了光的收集，最終獲得了更清晰、更明亮的圖像，其中還包含有關(guān)潛在分子功能、相互作用和環(huán)境的功能信息。

下圖提出了一種超分辨光學起伏圖像掃描顯微術(shù)的方案；設(shè)置在標準共焦顯微鏡的圖像平面中的針孔和單像素檢測器被替換為 23 像素的 SPAD 陣列，SPAD23單光子陣列探測器，增加了光線收集，提高了成像速度，減少了背景噪音，能夠在共聚焦顯微鏡中實現(xiàn)波動對比度的超分辨率。

當掃描樣品臺時，每個光子的檢測時間記錄在相連的 FPGA 電路中，并以數(shù)字形式存儲。然后分析該數(shù)據(jù)，為陣列中的每個像素對產(chǎn)生第二個相關(guān)圖像，產(chǎn)生 232個分辨率增強為 2 的相關(guān)圖像。如下圖b所示分辨率的提高可歸因于兩個因素。首先，如在 ISM 中一樣，每個小探測器的點擴展函數(shù)(PSF)是激發(fā)和其探測 PSF 的乘積。此外，從兩個這樣的 ISM PSFs 相乘得到的相關(guān)對比度實現(xiàn)了進一步的變窄。在對圖像進行適當?shù)囊苿右允蛊湎嗷ブ丿B之后，這一過程被稱為像素重新分配，我們在空間頻率域中應(yīng)用傅立葉重新加權(quán)濾波的最后階段。理論上，最終 SOFISM 圖像的 PSF 具有超過衍射極限 4 倍的橫向分辨率增強。

圖C展示了 SOFISM，對相對稀疏的單個 CdSe/CdS/ZnS核/殼/殼量子點(QDs)的樣品進行成像。除了由于衍射造成的模糊之外，標準的共焦圖像(CLSM)包含大量的噪聲，這是由于量子點的發(fā)射強度在亮和暗狀態(tài)(閃爍)之間的波動造成的。生成標準 ISM 圖像的分辨率提高了 2 倍，同時噪聲水平明顯降低，通過像素重新分配達到平均水平。或者，通過計算熒光信號的二階相關(guān)矩陣，然后重復(fù) ISM 過程的剩余部分(像素重新分配和傅立葉重新加權(quán)),產(chǎn)生分辨率提高 2.5 倍的更清晰的圖像。我們注意到，這個數(shù)字低于理論預(yù)測的數(shù)字，可能是由于探測器的有限尺寸、樣品振動和其他技術(shù)方面的原因。

最后，還可以生成互相關(guān)階數(shù)高于 2 的 SOFISM 圖像；上圖C展示了來自相同場景的 4 階相關(guān)圖像，產(chǎn)生橫向分辨率的 4倍增 強。 在類似的實驗條件下，盡管檢測方案有些麻煩，SOFISM 已經(jīng)被證明在軸向分辨率上提供了 2 倍的改進，雖然一些成熟的超分辨率技術(shù)已經(jīng)被生命科學研究團體采用并取得了巨大成功，但是 SPAD 陣列技術(shù)的最新進展為可以針對特定需求提供超分辨率解決方案。SOFISM 可以提供一種實驗上簡單的方法，在合理的曝光時間內(nèi)提供顯著的 3D 分辨率增強，并且沒有顯著的實驗復(fù)雜性。

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審核編輯黃宇