病原微生物的早期和快速檢測對(duì)于解決嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題至關(guān)重要。據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近日，埃及澤維爾科技城（Zewail City of Science and Technology）的科技大學(xué)（UST）及微生物學(xué)和噬菌體治療中心（Center for Microbiology and Phage Therapy）的研究人員構(gòu)建了一種基于噬菌體的新型納米生物傳感器，該傳感器對(duì)電化學(xué)阻抗測量法進(jìn)行了大量優(yōu)化，并將其應(yīng)用于食品樣品中大腸桿菌O157:H7的定量檢測。研究人員利用循環(huán)伏安法（CV）和電化學(xué)阻抗譜（EIS）確定了使用由金納米顆粒（AuNP）、多壁碳納米管（MWCNT）和氧化鎢（WO3）納米結(jié)構(gòu)組成的納米復(fù)合材料對(duì)一次性絲網(wǎng)印刷電極電化學(xué)性能的影響。納米材料的使用使其對(duì)靶向細(xì)菌宿主細(xì)胞具有很高的捕獲靈敏度，其檢測限（LOD）為3.0菌落形成單位（CFU）/ml。

此外，研究人員利用共價(jià)固定化活性噬菌體對(duì)幾種非靶向細(xì)菌菌株的選擇性進(jìn)行了測試，獲得了較高的特異性。在食品樣品中以高特異性成功地檢測到目標(biāo)食源性病原體，該傳感器提供了90%~108%的優(yōu)良回收率。因此，新開發(fā)的噬菌體生物傳感器被作為一次性無標(biāo)記阻抗生物傳感器，用于快速和實(shí)時(shí)監(jiān)測食品質(zhì)量。

阻抗測量是一種無標(biāo)記、高度敏感且不受復(fù)雜樣品基質(zhì)中混濁或有色組分影響的技術(shù)，其在此實(shí)現(xiàn)了構(gòu)建用于快速細(xì)菌識(shí)別的強(qiáng)大噬菌體納米傳感器。T4型噬菌體（ZCEC5）因其對(duì)大腸桿菌O157:H7的全細(xì)胞檢測的高靈敏度和選擇性，被選為活性生物識(shí)別元件。

為了將活性噬菌體有效地共價(jià)固定在用納米材料修飾的傳感器表面上，研究人員將4-氨基硫酚（4-ATP）自組裝到納米結(jié)構(gòu)表面上，進(jìn)而與戊二醛鏈活化以形成定向良好的自組裝單分子層（SAM），如圖1所示。同時(shí)，研究人員對(duì)其進(jìn)行了電化學(xué)表征（圖2A和2B），其中循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗譜測量表明，納米復(fù)合材料的摻入致使協(xié)同電化學(xué)增強(qiáng)（標(biāo)準(zhǔn)氧化還原探針的氧化還原反應(yīng)速率增加），這是由于氧化鎢和碳納米管具有較高的導(dǎo)電性、電催化活性及其表面積的擴(kuò)大。同時(shí)，電化學(xué)阻抗譜數(shù)據(jù)證實(shí)了納米復(fù)合材料對(duì)于降低阻抗信號(hào)的重要性，這是由于電子從溶液界面向電極表面的轉(zhuǎn)移速度加快了。

圖1 用于大腸桿菌快速阻抗檢測的噬菌體生物傳感方法的后續(xù)制作過程

圖2 （A）作為標(biāo)準(zhǔn)氧化還原探針的鐵氰化物（FCN，5 mMol）氧化還原反應(yīng)電極表面的循環(huán)伏安響應(yīng)；（B）作為標(biāo)準(zhǔn)氧化還原探針的鐵氰化物（FCN，5mMol）氧化還原反應(yīng)電極表面的阻抗響應(yīng)；（C）活性噬菌體固定前后電極表面的阻抗響應(yīng)；（D）基于噬菌體的納米生物傳感器制備步驟的FTIR光譜。

研究人員在四種不同的條件下，測試了將固定化噬菌體與其靶向宿主（大腸桿菌O157:H7）之間的選擇性結(jié)合相互作用轉(zhuǎn)化為可測量和可量化的阻抗信號(hào)。噬菌體傳感器對(duì)細(xì)菌懸浮液的捕獲效率是在沒有氧化還原介質(zhì)的磷酸鹽緩沖液（PBS，作為唯一電解質(zhì)）中測量的，或使用包括鐵氰化物或2,6-二氯靛酚鈉（DCIP）的單一介質(zhì)測量。最終，研究人員應(yīng)用了兩種介質(zhì)（DCIP/FCN）的組合。結(jié)果表明，當(dāng)使用雙介導(dǎo)系統(tǒng)（DCIP/FCN）時(shí)，獲得了代表最高靈敏度的最高阻抗信號(hào)。如圖3A所示，僅使用鐵氰化物，以及在沒有任何氧化還原介質(zhì)的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜測量，奈奎斯特圖均未顯示出任何顯著變化。因此，研究人員才選擇了雙介導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 （A）電化學(xué)阻抗譜奈奎斯特圖顯示噬菌體傳感器對(duì)所選病原體菌株的捕獲效率；（B）傳感時(shí)間對(duì)噬菌體生物傳感器產(chǎn)生電化學(xué)阻抗譜信號(hào)的影響。

針對(duì)噬菌體生物傳感器的選擇性和效率，研究人員在多細(xì)菌濃度范圍內(nèi)（從101~10? CFU/ml）進(jìn)行了評(píng)估，同時(shí)記錄了每種濃度的電化學(xué)阻抗譜，如圖4A奈奎斯特圖所示。結(jié)果表明，細(xì)菌濃度的增加與阻抗信號(hào)的增加有強(qiáng)相關(guān)性，如圖4B所示。為了提取圖中的Rct值，研究人員對(duì)特定的等效電路進(jìn)行了建模（圖4C）。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到10? CFU/ml時(shí)，該傳感器表面發(fā)生的連續(xù)結(jié)合事件導(dǎo)致的Rct增加值達(dá)到最大。在該濃度下，該傳感器達(dá)到了一種表面飽和水平，這是噬菌體傳感器捕獲目標(biāo)宿主細(xì)胞的最大容量。該研究的檢測限為3.0 CFU/ml，達(dá)到了極高的靈敏度。

圖4 （A）由發(fā)生在噬菌體生物傳感器表面的成功結(jié)合事件產(chǎn)生的阻抗校準(zhǔn)曲線的奈奎斯特圖；（B）Rct值變化與細(xì)菌計(jì)數(shù)增加的關(guān)系；（C）用于提取電化學(xué)阻抗譜參數(shù)的Randles等效電路。

由于生物識(shí)別元件的選擇對(duì)于提供最大的選擇性和特異性始終是很必要的，因此針對(duì)新開發(fā)的基于噬菌體的生物傳感器的生物傳感性能，在許多其它細(xì)菌菌株中也進(jìn)行了測試，如圖5所示。結(jié)果顯示，當(dāng)測試外來細(xì)菌菌株時(shí)，該傳感器獲得了高選擇性，而響應(yīng)并不顯著。因此，該噬菌體作為生物識(shí)別元件為靶向生物體提供了快速、選擇性和定量的阻抗測量檢測。

圖5 基于噬菌體的生物傳感器對(duì)靶向和非靶向菌株的阻抗響應(yīng)

為了確保基于噬菌體的生物傳感器可用于樣品分析，研究人員對(duì)各種食品樣品（包括牛肉、白奶酪、番茄汁、自來水和午餐牛肉樣品等）的合成細(xì)菌污染（將大腸桿菌O157:H7以103 CFU/ml的濃度加入食品樣品）進(jìn)行了測試。同時(shí)，未感染（未污染）的樣本也作為陰性對(duì)照納入該測試。針對(duì)每個(gè)樣品，研究人員使用單獨(dú)的傳感器芯片，并計(jì)算ΔRct的變化。進(jìn)行該試驗(yàn)的同時(shí)，研究人員進(jìn)行了CFU平板計(jì)數(shù)來驗(yàn)證。獲得了90%~100%的回收率。

綜上所述，隨著高傳染性菌株的不斷出現(xiàn)和細(xì)菌感染的增加，電化學(xué)納米生物傳感器的開發(fā)通常僅用于一次性測試，以提供快速的現(xiàn)場檢測，免除傳感器的清潔程序同時(shí)避免交叉污染。本文中，研究人員使用由金、氧化鎢和多壁碳納米管（Au/WO3/MWCNT）組成的納米復(fù)合材料對(duì)一次性絲網(wǎng)印刷電極進(jìn)行功能化，以提供高電催化和電化學(xué)讀數(shù)。

作為一種生物識(shí)別元件，裂解噬菌體（大腸桿菌T4型病毒）被共價(jià)固定在納米傳感器的表面，該傳感器與4-氨基硫酚和戊二醛的自組裝單分子層交聯(lián)。研究人員采用伏安法和阻抗法對(duì)樣品進(jìn)行電化學(xué)表征，用阻抗法對(duì)樣品進(jìn)行了分析優(yōu)化和實(shí)際樣品分析。基于噬菌體的生物傳感器提供的高靈敏度和選擇性，成功地對(duì)食品樣品進(jìn)行了分析。因此，該生物傳感器非常有前途，并為使用一次性和現(xiàn)場設(shè)備進(jìn)行病原體診斷開辟了一條新途徑。

審核編輯：劉清