多重核酸檢測在病原體鑒定、癌癥風險等應用中具有重要價值。目前多重核酸檢測常規(guī)方法是使用不同發(fā)射波長的特異性熒光探針并結合其不同的熒光強度來識別不同核酸靶標，但這面臨著涉及熒光探針復雜以及綜合平衡反應效率困難等問題。其它方法如熒光溶解曲線分析、圖案或微球編碼等在多路復用的靈活性、準確定量能力、經濟效益方面需要改進。

近期，深圳大學李自達課題組基于前期開發(fā)的微孔陣列芯片（Biosens.Bioelectron. 2023, 220, 114913），并結合顏色編碼和深度學習圖像分析，實現了高通量數字化多重核酸檢測。相關研究成果以“CoID-LAMP: Color-Encoded,Intelligent Digital LAMP for Multiplex Nucleic Acid Quantification”為題發(fā)表在Analytical Chemistry期刊上。

在該研究中，研究團隊使用基于顏色編碼液滴的數字環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術，結合智能圖像分析（Color-Encoded，IntelligentDigital LAMP，CoID-LAMP），進行多重核酸定量分析。CoID-LAMP通過將不同顏色的染料混入到不同的環(huán)介導等溫擴增引物內，并生成微液滴，完成顏色對引物的編碼，并將樣本微滴化處理（圖1a），然后將兩種液滴分別加載到微孔陣列芯片內，使引物液滴與樣本液滴一對一隨機配對、融合以及環(huán)介導等溫擴增（圖1b）。隨后，通過對液滴顏色進行分析，解碼引物信息；并且利用深度學習算法模型檢測液滴內的沉淀副產物，從而確定每種靶標的液滴占用率并根據泊松分布實現多種靶標的數字絕對定量。

圖1 基于顏色編碼液滴的數字環(huán)介導等溫擴增（CoID-LAMP）流程示意圖

為準確識別擴增后含有沉淀的陽性液滴與無沉淀的陰性液滴，研究團隊利用YOLOv5的深度學習算法開發(fā)了一個液滴檢測模型，并驗證了該檢測模型的準確性能（平均精度均值為0.97）。

圖2 深度學習模型結構與分析性能展示

在構建深度學習液滴檢測模型后，研究團隊表征了CoID-LAMP進行數字核酸擴增檢測的分析性能。對不同濃度的單一核酸靶標按照CoID-LAMP方法進行了檢測（除引物類型僅有一種外，其余按照CoID-LAMP方案執(zhí)行）。液滴檢測模型準確地識別了陽性與陰性液滴，在已知濃度為1.27 × 102 ~ 1.27 × 10? copies/μl時，CoID-LAMP的檢測結果與已知濃度具有良好的一致性。通過對該范圍內數據線性擬合，得到CoID-LAMP檢測值與實際值之間的關系，R2為0.9986，這表明了CoID-LAMP具有優(yōu)秀的核酸定量能力。

圖3 CoID-LAMP在核酸定量中的性能表征

為了驗證CoID-LAMP的多路復用能力，研究團隊首先使用了生物醫(yī)學應用廣泛的熒光染料作為液滴編碼材料，通過3種激發(fā)波長的熒光染料對8種引物液滴進行了編碼，建立了8重核酸分析策略。首先利用LAMP的高度特異性去驗證了熒光染料進行液滴編碼-解碼的準確性，即通過已知的染料去編碼引物液滴，并與單一核酸靶標液滴進行配對、融合、擴增，擴增后的LAMP陽性液滴其對應的熒光編碼是唯一的，且與該靶標對應的引物熒光編碼保持一致。

圖4 使用熒光染料進行液滴編碼和解碼準確性的驗證

在驗證了熒光染料進行液滴編碼與解碼的準確性后，研究團隊根據CoID-LAMP的數字定量范圍，預設了已知濃度的多靶標核酸樣本，并按照CoID-LAMP方案進行了多靶標定量分析，結果顯示，檢測濃度與已知濃度具有良好的一致性。

圖5 使用熒光染料編碼進行多種核酸分析

為進一步降低對檢測設備的需求，研究團隊使用了明場的彩色染料作為液滴編碼材料，通過3種染料對4種引物液滴編碼，建立了4重核酸分析策略。同樣地，驗證了明場染料進行液滴編碼-解碼的準確性。

圖6 使用彩色染料的液滴編碼和解碼準確性的驗證

最后，研究團隊預設了已知濃度的4重靶標核酸樣本，使用3種染料對4種引物液滴編碼，按照CoID-LAMP方案進行了多靶標定量分析，結果證明了基于明場染料的CoID-LAMP核酸定量的準確性。

圖7 使用彩色染料對液滴編碼進行多重核酸分析

綜上所述，該研究開發(fā)的CoID-LAMP技術具有檢測成本低、操作簡單、對儀器要求低的優(yōu)勢，為開發(fā)適用于POCT的多重核酸檢測系統提供了新的解決方案。





審核編輯：劉清