雙光子激發(fā)熒光（TPEF）顯微鏡，也稱為雙光子顯微鏡，是對活體組織深層三維成像的首選方法。深度成像是TPEF顯微鏡固有的優(yōu)勢，它使用了更長的激發(fā)波長（通常是近紅外波段），因而其帶來的散射比傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡中所使用的較短的可見波長更少。更長的波長同時也減少了來自散射光的背景照明，并增加了在更高深度處的對比度。目前，用TPEF顯微鏡可以獲得1mm深度的體內(nèi)大腦圖像。

在熒光顯微鏡中，當(dāng)兩個獨立的光子被一種介質(zhì)同時吸收時，就會發(fā)生雙光子激發(fā)。這需要兩個合適能量的光子在這樣的介質(zhì)上時間和空間上同時重合；通常來說這不需要非常大的激發(fā)光子通量，當(dāng)然光子通量越大， 雙光子同時被吸收的概率就越大。在TPEF顯微鏡中，更高的光子通量會帶來更高的效率，從而帶來圖像質(zhì)量和分辨率的提升。

在TPEF顯微鏡中，雙光子激發(fā)所需的大光子通量更多的是通過寬波段可調(diào)諧的鈦寶石飛秒激光器實現(xiàn)的，激光器典型規(guī)格脈寬為100fs，重復(fù)頻率約為80MHz，這可以給雙光子顯微鏡帶來非常高的峰值功率和大光子通量。然而，激光器較高的平均功率（在1~4瓦范圍內(nèi)）會由于激發(fā)波長的線性吸收引起的與介質(zhì)的光熱相互作用而造成熱損傷。這種效應(yīng)在體內(nèi)成像中尤其重要，因為溫度超過40oC會導(dǎo)致不可逆的損傷。因此，傳統(tǒng)的固態(tài)激光器所提供的平均功率必須被衰減才能實際應(yīng)用于TPEF顯微鏡，峰值功率也會相應(yīng)地降低。保持較低的平均功率以避免熱損傷，同時縮短脈沖持續(xù)時間是一種替代的提高峰值功率的方法。這減少了光子落在介質(zhì)上的時間間隔，同時提高了介質(zhì)被吸收的概率。

近日，西班牙FYLA公司首次利用先進(jìn)超連續(xù)譜全光纖激光器技術(shù)得到脈沖寬度短至15fs的商業(yè)激光器，命名型號“SCH”。與傳統(tǒng)的100fs激光器相比，SCH的15fs脈沖寬度可在相同平均功率水平下提供超過傳統(tǒng)飛秒激光器7倍的光子通量。

圖1：FCH 寬光譜光纖飛秒激光器，波長范圍950-115nm，脈沖寬度15fs, 峰值功率>200kW

圖2：藍(lán)色線：SCH 飛秒激光器光譜曲線；橙色線：1um波段百秒激光器光譜曲線；灰色線：紅色熒光蛋白DsRed吸收截面光譜

但是，巨幅提高每個時間和面積上可用光子數(shù)量對圖像的真正影響是什么呢？

一、更高的激發(fā)效率，更高的圖像亮度

理論上，在雙光子顯微鏡中，圖像的亮度與激發(fā)效率直接相關(guān)，而激發(fā)效率完全依賴于光子通量和熒光團(tuán)的二階非線性激發(fā)截面(GM) 。作為一個例子，我們可以嘗試計算熒光蛋白mRFP在15fs激光脈寬（如SCH飛秒激光器）和1050nm中波長照射下的激發(fā)效率。與100fs的激光器相比，15fs激光器具有更寬的帶寬（達(dá)200nm），可以在900到1200nm之間激發(fā)mRFP，與100fs激光器的11nm相比，這是一個更寬的光譜區(qū)域。

圖3：藍(lán)色曲線：以1050nm為中心的SCH 15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率；橙色曲線：以1050nm為中心的100fs光纖飛秒激光器的峰值功率；黑色曲線：mRFP的二階非線性激勵截面(GM)

考慮到各波長的峰值功率和激發(fā)截面，可以計算出mRFP的激發(fā)效率。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)100fs激光器相比較，SCH飛秒激光器15fs的脈沖寬度使得激發(fā)效率提高了50%。

圖4：藍(lán)色曲線：SCH 15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率；橙色曲線：100fs光纖飛秒激光器的峰值功率；黑色曲線：mRFP的二階非線性激勵截面(GM)

圖5：小鼠腸道切片的2P熒光顯微鏡圖像，用SYTOX Green標(biāo)記細(xì)胞核（黃色）和Alexa Fluor 568煥鈦標(biāo)記肌動蛋白絲（藍(lán)色）

二、多色同時激發(fā)

想象一下，同時成像多個波段范圍的熒光團(tuán)，而不必考慮選擇最佳激發(fā)波長的激光器。在雙光子顯微鏡中，使用傳統(tǒng)的100fs激發(fā)激光器，這通常是一個復(fù)雜的，有時甚至是不可能完成的任務(wù)。

傅里葉變換極限的100fs近紅外固體飛秒激光器（例如鈦寶石飛秒激光器、920nm光纖飛秒激光器）的光譜寬度通常在10~20nm范圍內(nèi)，它們只能同時激發(fā)激發(fā)光譜在10~20nm光譜范圍內(nèi)的熒光團(tuán)。因此，若想用單臺激光器去同時激發(fā)更多種類的熒光團(tuán)就需要帶寬更寬，脈沖更短的激光器。

SCH寬光譜飛秒激光器在提供15fs脈沖寬度的同時以1050nm為中心波長提供200nm的帶寬，在這個帶寬范圍內(nèi) （橫跨900到1200nm）的所有綠色和紅色的熒光團(tuán)都可以同時被這種激光器激發(fā)。這對于雙光子顯微鏡來說，同時對多個熒光團(tuán)成像成為一個可行的，實用的和簡單的替代。

圖5：常見熒光探針激發(fā)波長

圖6：小鼠腸道的雙光子熒光顯微鏡圖像

用Sytox Green標(biāo)記細(xì)胞核（洋紅色），F(xiàn)ITC濾波器；用Alexa Fluor 568 Phaloidin標(biāo)記肌動蛋白絲（綠色），TRITC過濾器。

兩種熒光標(biāo)記物同時被SCH激光器激發(fā)，用尼康的熒光濾片組過濾熒光。

Image taken at ICFO-SLN the Super-Resolution Light Microscopy at ICFO- Institute of Photonics Sciences, Barcelona, Spain。

綜上所述，F(xiàn)YLA公司推出的新型、緊湊而強(qiáng)大的SCH全光纖飛秒激光器激光器，提供15fs的脈沖持續(xù)時間和一流的高峰值功率（>200kW），為體內(nèi)樣本的低光損傷激發(fā)提供了強(qiáng)大的工具。結(jié)合全光纖激光器的緊湊性和堅固性性，SCH飛秒激光器成為雙光子顯微鏡的特殊激光選擇。

現(xiàn)在，F(xiàn)YLA公司推出SCH飛秒激光器的免費測試服務(wù)，包括運輸和安裝，無需承諾購買，此外對已購買的客戶提供全面免費2年質(zhì)保優(yōu)惠政策，如果您對SCH激光器感興趣并有意測試使用，請隨時聯(lián)系上海昊量光電設(shè)備有限公司。

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