血小板由巨核細胞衍生而來，具有止血作用。骨髓和肺是血栓形成的主要部位，但其機制尚不清楚。此外，在體外生成的血小板功能性很差。近日，來自英國布里斯托大學的Alastair W. Poole和Xiaojuan Zhao教授團隊進行了利用微流控技術在肺血管系統中高效生成血小板的相關研究。研究成果以“Highly efficient platelet generation in lung vasculature reproduced by microfluidics”為題發表在Nature Communications期刊上。

在體外小鼠肺血管中灌注巨核細胞可產生大量血小板，每個巨核細胞可產生多達3000個血小板。盡管巨核細胞體積較大，但它們仍能反復通過肺血管，在血管中巨核細胞去核然后生成血小板。通過使用體外人工肺和微流控芯片，該研究明確了氧合、通氣、肺內皮和微血管結構是如何支持血栓生成的。此外，還顯示了肌動蛋白調節因子原肌球蛋白4（TMP4）在肺血管血小板形成最后步驟中的關鍵作用。該研究揭示了肺血管中血栓形成的機制，并為大規模生成血小板提供了可靠的方法。

體內肺血管中血小板高效生成

研究表明，肺是血小板生成的主要部位之一，但這種血小板生成的機制并不清楚。該研究在體內和體外建立了小鼠心肺模型，通過該模型能夠灌注小鼠巨核細胞（MKs）。體外小鼠心肺模型的基礎是將心肺分離成一個整體，結扎腔靜脈和主動脈弓并灌注預染色的成熟MKs。首先對肺部進行人工通氣。由于MKs體積較大，原設想絕大多數MKs會被困在肺血管中，但第一次超過50%的完整MKs可以出現在灌流液中。灌流液可以通過肺部再次注射，多次注射后，灌流液中完整MKs的數量繼續減少。隨著傳代次數的增加，每個MK產生的血小板數量逐漸增加，18次傳代后達到約931.7 ± 138.4個血小板/MK。傳代后固定肺切片進行雙光子顯微鏡檢查顯示，肺微血管中可見許多生成的血小板。經過18次肺部穿刺后，每個MK產生了約2997.0 ± 270.5個血小板，即體內每個MK產生約1000 ~ 4000個血小板。總之，在MKs通過肺微血管多次循環后，可以產生生理數量的血小板。

圖1 小鼠血小板由通過小鼠肺血管的巨核細胞生成

圖2 肺內皮細胞健康和微血管結構在血小板生成中的作用

生成的血小板形態和功能正常

接著研究人員明確心肺系統中生成的血小板是否具有經典的形態和功能。用α-微管蛋白免疫標記生成的血小板顯示具有典型的環狀結構，細胞的平均大小比對照組大。根據生成血小板的直徑范圍，分為兩個亞群：約33%的生成血小板與對照血小板大小相似，67%的生成血小板明顯大于對照血小板。透射電子顯微鏡（TEM）觀察生成血小板的超微結構也顯示：血小板呈盤狀，具有α顆粒、致密顆粒、線粒體、管狀系統和微管線圈等。與尺寸較小的亞群相比，尺寸較大的亞群在整合素αⅡbβ3激活和P-選擇素表達方面對凝血酶的反應更強。生成血小板和對照血小板的CD61和CD42b的平均熒光強度（MFI）相當。然而，盡管表達CD61的細胞比例也相當，但與對照組相比，生成血小板中表達CD42b的細胞比例較低。生成的血小板中三種膠原受體CD42d24、CD49b和糖蛋白VI（GPVI）的平均熒光強度（MFI）高于對照組。對體外血栓形成進行評估顯示，生成的血小板占據血栓的所有層面，而對照組血小板主要位于血栓的頂部，表明生成的血小板對膠原蛋白有更高的反應性，生成的血小板是早期與膠原相互作用的血小板，具有更大的粘附性能。

圖3 生成的血小板具有與正常血小板相似的外觀和功能

巨核細胞脫核和血小板在血管內的釋放

研究人員進一步探索反復通過肺血管時MKs釋放血小板的過程。結果顯示在反復傳代后，MKs的細胞核逐漸向外周移動，隨后去核，產生裸核和去核MKs。雖然發現了少量有核圓形MKs，但較大的無核物逐漸積累。表明大的多倍體細胞核在極化過程中從細胞中心位置向外周移動。進一步通過肺血管時，細胞核從細胞中擠出，直到第9次傳代時，有核的MKs所剩無幾。經過12次傳代后，大的裸核也變得稀少，取而代之的是不規則的小亞核。這些亞細胞核看起來相互連接。子核的特征是深度、長寬比、主軸和次軸都隨傳代的增加而大幅減少。因此，擠出的裸核經歷了一個分裂為多個組成亞核的過程，這些亞核進而凝結成具有較大圓度的緊湊亞核單位。無核的MK經過多次傳代后分裂成血小板，到15 ~ 18次傳代時達到高峰。

圖4 巨核細胞在破碎前出現核邊緣化和去核現象

肺血管中血小板生成需要原肌球蛋白4進行調節

血小板的釋放涉及肌動蛋白細胞骨架重組，肌球蛋白與肌動蛋白絲形成共聚物，并以同工酶方式調節肌動蛋白絲的功能。TPM4在血小板形成中發揮作用，但在體外人工肺系統中，Tpm4-/- MKs在灌流液中不生成血小板。因此，研究人員探索了血小板生成需要TPM4的步驟。與野生型MKs相比，在前3個傳代期間，較少的Tpm4-/- MKs轉變為大的無核物。到6 ~ 9代時，大核物體的數量與野生型相當。雙光子顯微鏡觀察固定的肺切片顯示，18個傳代后，出現大量的核熒光物，表明TPM4在調節無核化過程中的作用很小且非必要，但在調節血小板形成的最后步驟及其釋放到循環中的過程中起著關鍵作用。在心肺模型中，TPM4在血小板生成中起著關鍵作用。接著研究人員研究了Tpm4-/- MKs在骨髓中是否與WT相似。在WT或Tpm4-/-小鼠中，觀察到MKs從骨髓間隙到竇狀的4種不同形態，在肺血管中，TPM4調節約10 μm無核碎片向血小板的轉化。此外，TPM4可能在調節肺血管以外的器官中生成的血小板最終大小方面起一定作用，因為Tpm4-/-小鼠的血小板體積比野生型小鼠略大。

綜上所述，該研究開發了一種在體外高效生成血小板的方式，即在通氣條件下通過肺血管反復注射MKs。此外，還發現巨核細胞去核過程、生成血小板的最后步驟以及血小板釋放到循環中依賴TPM4。這些發現將為大規模生產人類血小板提供一個新方法。





審核編輯：劉清