數字PCR（dPCR）技術由于其絕對定量的能力和極高的靈敏度，被廣泛的應用于分子診斷領域。然而，與目前的金標準定量PCR（qPCR）相比，dPCR在動態范圍上落后了3 ~ 4個數量級，這極大地限制了其在臨床領域的應用。例如，對一些載量范圍波動較大的病毒感染樣本進行定量時，高載量的樣本往往會使dPCR顯全陽性而無法通過泊松分布定量。因此，亟需開發一種比目前的dPCR動態范圍更大且簡便易用的新的dPCR策略。

近期，上海科技大學劉一凡課題組與中科院上海微系統所、南方醫科大學南方醫院團隊合作開發了熒光編碼對數稀釋數字PCR技術（Flodd-PCR），該方法展示出的動態范圍為10?，比傳統dPCR高了逾兩個量級。相關研究成果以“Fluorescence-coded logarithmic-dilution digital droplet PCR for ultrawide-dynamic-range nucleic acid quantification”為題，發表在Biosensors and Bioelectronics期刊上。上?？萍即髮W物質科學與技術學院劉一凡課題組2023屆碩士畢業生施清源、2021級博士研究生李婕、南方醫科大學南方醫院檢驗科劉春辰博士為本文共同第一作者，上海科技大學劉一凡研究員、中科院微系統研究所羅源副研究員、南方醫科大學南方醫院鄭磊教授為本文通訊作者。

Flodd-PCR基本工作原理

如圖1所示，Flodd-PCR的基本原理為在一次dPCR反應中引入四種對數稀釋的樣本濃度，每種稀釋倍數分別對應一種濃度指示劑熒光強度；在PCR后，液滴將被根據熒光強度拆分成四組，每組分別進行拷貝數定量。如此以來，一次Flodd-PCR實驗約等效于四組進行梯度稀釋的、平行的dPCR實驗，從而大幅提高了動態范圍。

為了實現上述概念，研究團隊首先設計并開發了一種微流控芯片，該芯片能夠實現對檢測樣本的連續對數梯度稀釋（20 ~ 1000倍）和并行液滴生成（圖2），Flodd-PCR芯片一共有兩個入口，一邊通入待檢測的模板DNA樣本和熒光指示劑，一邊通入PCR所需的其他試劑：酶、引物、探針等。上述兩種溶液經過連續梯度稀釋后將生成4組液滴，每組的液滴內DNA模板和熒光指示劑都稀釋在一個特定的濃度，同時又使其他試劑（如引物、探針和聚合酶等）保持在正常工作濃度。在熱循環后，利用商業化數字PCR液滴閱讀儀同時讀取PCR探針熒光和稀釋指示劑熒光，最終根據熒光指示劑將混合的液滴分成四個聚類，并分別計算拷貝數。

圖1 Flodd-PCR原理流程圖

圖2 Flodd-PCR芯片設計及稀釋性能表征

Flodd-PCR的動態范圍表現及臨床有效性驗證

接下來，研究團隊通過一系列實驗表征了Flodd-PCR的實際動態范圍，如圖3所示。實驗結果表明常規dPCR的動態范圍僅為4 ~ 40,000拷貝/μL，而Flood-dPCR得益于連續梯度稀釋的功能，能夠將檢測動態范圍擴寬到4 ~ 20,000,000拷貝/μL。此外，團隊還將Flodd-PCR和其他的代表性高動態范圍dPCR方法進行了橫向比較，結果表明Flodd-PCR在實現超高動態范圍的同時并沒有增加液滴的數量，這意味著Flodd-PCR的液滴讀取和傳統dPCR一樣簡便。

圖3 Flodd-PCR的動態范圍標準

最后，為了驗證Flodd-PCR在臨床檢測上的實用性，研究團隊將其應用于臨床患者樣本中人乳頭狀瘤病毒HPV（16型）的定量檢測。HPV-16作為高危病毒類型可以在70%的宮頸癌病例中發現，其病毒載量的動態區間可達10?以上，遠超出了傳統dPCR的動態范圍（約10?）。實驗結果表明（圖4），得益于更高的動態范圍，Flodd-PCR的定量成功率優于dPCR，其定量結果也和金標準qPCR高度一致。以上結果表明，Flood-PCR技術可以運用到真實的臨床案例中。

綜上所述，Flodd-PCR是一種新穎的超高動態范圍的數字PCR技術，其巧妙地運用了微流控技術和熒光編解碼策略，實現了多種濃度樣本檢測的“多路復用”。此外，Flodd-PCR在操作流程上與傳統數字PCR高度一致，甚至兼容商業化數字PCR設備，這使得該技術在實際推廣上具有重要優勢。

圖4 Flodd-PCR對臨床HPV樣本的高動態范圍定量






審核編輯：劉清