★歡迎引用:

Yang, H., Huang, W., Chu, S., Zhang, X., & Wang,X. (2024). In situ assessment of stress level in perch during cryogenicwaterless live transportation using multisource impedance electrodes. Sensorsand Actuators A: Physical, 115083.

★研究背景

傳統的活魚應激水平判定基于生化指標測試方法，例如血糖，皮質醇等，面臨著費時費力的困境。為此，中國農業大學王想副教授、張小栓教授團隊開發了基于三種材質和四種形狀的阻抗電極以及后端的阻抗測量系統，用于無水低溫環境下鱸魚的應激水平監測。試驗旨在比較電極的不同材質和形狀對測量結果的影響和通過測量肌肉收縮變化來準確評估魚類的應激狀態。結果表明，片狀同側，銅材質的電極是監測鱸魚應激水平的最佳電極，通過數據挖掘和形態學特征提取方法將12h內鱸魚的應激水平分為急性應激，體內調節，適應應激，累積應激和瀕死五個階段，該結果與標準的血糖數據相匹配。基于ANN模型的應激水平預測模型取得了高達91.66%的預測精度，證明了系統的有效性。這項研究有利于提高活魚運輸過程中的健康管理水平，為推動智慧漁業的發展邁出了一步。

★ 文章解析

以鱸魚為例，本研究探討了使用阻抗譜法判定鱸魚應激水平的可行性，還重點關注了不同阻抗電極對鱸魚應激水平的預測效果，圖1展示了本文的研究框架。我們提出了一種創新的方法來評估魚類的壓力水平，包括比較電極屬性和通過測量肌肉收縮變化來準確評估魚類的應激狀態。根據壓力水平評估結果，我們將鱸魚分為不同的應激等級，以便針對不同等級的魚類制定相應的調控措施。此外，壓力水平評估還可以幫助監測鱸魚在不同環境和運輸條件下的應激反應。基于機器學習算法的應激水平預測模型取得了高達95.16%的預測精度，隨著時間的增長，活魚的應激水平不斷增加，與實際的血糖數據相匹配。這項工作有利于準確把握活魚運輸過程中的應激狀態，從而為相關人員提供決策依據。

圖1：框架圖

鮮活的鱸魚從北京市圣熙八號市場直接購買，然后立即有水充氧運輸至國家食品質量安全北京實驗室。所有的魚體均是健康無損傷的，經過禁食1.5天后，對魚體進行降溫處理，速率控制在3℃/h，此步的目的是誘導鱸魚進行最佳的休眠溫區。然后立即放入無水保活包裝袋中，試驗溫度保持在4℃左右。試驗分為兩個批次進行。

試驗1：確定最優的電極材料和電極形狀。針對三種材料的五種貼附方式，取15條鱸魚對15種電極進行尋優試驗。具體體現在，針對鱸魚從健康到瀕死的過程，使用試驗電極對魚的兩種狀態進行阻抗譜測量。默認實驗開始時鱸魚的生命健康特征最為明顯。默認鱸魚的呼吸頻率首次為0的狀態為其瀕死狀態。記錄鱸魚從健康到瀕死的持續時間。

試驗2：進行最優電極的持續監測試驗和生化指標測試試驗。試驗2分為兩組，第一組根據試驗1中篩選中的最優電極，選擇10條鱸魚進行長期的健康監測試驗，旨在采集鱸魚生理阻抗信號的變化規律，阻抗信號采集頻率定義為10min/次。試驗時間根據試驗1中鱸魚從健康到瀕死的持續時間決定。第二組，每隔1h進行鱸魚血糖濃度的采集，并觀察鱸魚的呼吸頻率變化。該步驟旨在反映鱸魚在試驗過程中的真實應激水平。

圖2：試驗圖

在選擇最優電極時，分別對鱸魚的初始狀態和瀕死狀態進行阻抗譜測量。（默認初始狀態為肌肉收縮，瀕死狀態為肌肉舒張）結果如圖3所示。電極帶的長而窄的電極表面適合于大面積魚肉樣品的測量，能夠更好地與樣品接觸，但使用電極帶測量時需環繞魚體，操作較為繁瑣。測得的數據中，模值數據相差不大，相角數據只有銅電極區分較為明顯，如圖3a所示。圓環電極測量位置為軀干中間較為平坦的地方，有利于增加電極與魚體的接觸面積。測得的數據中，模值數據幾乎相同，銅電極和不銹鋼電極的相角數據有一定的區分，如圖3b所示。但實際操作中發現，該結構的電極限制了測量對象在中心區域的濕潤程度，可能影響在該區域內阻抗測量結果的重復性。片狀電極測量位置選擇在魚背鰭和軀干相交的位置，為防止測量時片狀電極的偏移現象，將無塵布潤濕后搭配片狀電極緊緊貼附在魚體表面。

片狀電極有同側排列和異側排列兩種數據收集方式，如圖3c-d所示。測量的相角數據無論低頻和高頻都很順滑，沒有明顯的毛刺，同側電極的測量結果由于異側電極，對鱸魚不同的狀態有著非常明顯的區分。針狀電極具有尖銳的幾何形狀，能夠集中電場，提供較高的局部電場強度。如圖3e所示，針狀電極相比與上述結構的電極，它插入了魚體的內部。數據整體較為順滑，沒有明顯的鋸齒和毛刺，數據質量較為不錯，對鱸魚不同的狀態有著明顯的區分。材料方面，可以明顯看出不同材料在同一電極形狀下趨勢基本相同，所以在材料對測量結果的影響不大。

銀具有最佳的電導率，但是，銀電極成本較高，且易受環境影響，同時，銀也對魚體具有一定的毒性。不銹鋼的電荷傳遞效率較低，且易發生腐蝕現象，從而影響到實驗結果的準確性。相比之下，銅電極因其較高的電導率能夠實現與魚體之間更高效的電學信號傳遞。同時，銅相比銀和不銹鋼而言更加耐用，能夠有效降低試驗的成本。因此，選擇銅電極作為后續試驗的電極。綜上所述，銅材料的片狀電極和針狀電極的效果較為優秀，選擇這兩種電極進行下一步研究。同時片狀和針狀分別為無損接觸式和有損插入式，是兩種不同類型的電極。

圖 3：測量數據

相比于阻抗譜的模值曲線，相角曲線擁有更為豐富的圖像信息，從細胞層面來分析也該是如此。圖4a-c展示了鱸魚在無水低溫環境下的細胞電流路徑變化。其中，具有導電特性的胞外液和胞內液可等效為電阻，具有絕緣特性的細胞膜可等效為電容。根據電路理論，被細胞膜阻斷的低頻電流只能通過細胞外液（圖4a）。但高頻電流能夠穿過細胞膜同時經過細胞外液和與細胞內液（圖4b）。細胞膜上存在多種離子通道，當這些通道受到適當的刺激或調節時，離子通道會開放，允許特定離子通過。這些離子的運動也會形成電流（圖4c）。電流流經路徑的不同在模值曲線上只能反應為數值大小的變化，但在相角曲線上，由于呈容性的細胞膜的狀態的變化，導致其會發生大小以及曲線彎曲度的變化，所以相角頻率曲線包含的信息更多，因此使用相位角數據進行下一步的分析。

細胞膜上存在多種離子通道，當這些通道受到適當的刺激或調節時，離子通道會開放，允許特定離子通過。這些離子的運動會形成電流，在細胞膜上產生電位變化，從而導致細胞膜的導電性增強。圖4d-e分別展示了片狀電極和針狀電極的相位角測量結果。對阻抗譜曲線進行了特征的提取，圖中的曲線呈“S”形分布，緊密分布，相互交叉。為了更好地研究這一區域，以針狀電極為例，將圖4e的紅框區域放大，可明顯的觀察到不同時間下相角曲線的交叉(圖4f)，這證明了區域內的相角斜率隨時間變化，這里將其考慮為表示鱸魚應激水平的形態學特征參數。在實際應用中，由于近似直線上相鄰兩點的斜率相差不大，因此在計算直線斜率時，自動定位直線端點比較復雜。但曲線的峰谷點總是唯一的。因此，用峰谷點代替直線端點來計算鱸魚應激水平的形態特征參數如圖4g所示。

片狀電極和針狀電極在不同頻率下的形態特征參數（相角斜率）分別如圖4h和圖4i所示。片狀電極由于貼附在魚體上，其形態特征參數曲線相較于插入式的針狀電極有些許鋸齒。但總體來說兩個形態特征參數曲線的趨勢大致上是相同的，先上升，然后經歷一段平穩期，接著下降，之后又是上升，最后再單調下降。且兩個曲線的極值點出現的次數也較為一致。兩個曲線均能分辨出魚的不同階段，但在電極選優的試驗中，我們觀察到作為插入式的針狀電極的測試對象的魚，相比于無損的貼附在魚體表面的片狀電極其進入瀕死狀態的時間要快，也就是說插入式的針狀電極雖然數據較為穩定，固定性較好，但是其會影響鱸魚的存活時間，因此我們最終選擇無損的片狀電極作為最優電極。

圖 4：電極原理

為準確地識別鱸魚應激水平的模式，我們分析了整個過程中血糖濃度和呼吸頻率的變化，如圖5a所示。在最初的3小時內，鱸魚的血糖水平急劇下降。這種下降可能是魚類對低溫環境的反應，它們將體內儲存的糖原轉化為葡萄糖以對抗寒冷，導致血糖濃度降低。在3-5小時的時間段內，鱸魚適應了低溫環境，其代謝能力部分恢復，并導致血糖濃度反彈。在5-8小時內，隨著鱸魚適應環境，出現了輕微的應激反應，在這個反應過程中，細胞消耗葡萄糖生成ATP，導致血糖濃度短暫下降。在這種下降后，胰高血糖素的釋放增加，促進肝糖原的分解和非葡萄糖物質轉化為葡萄糖，最終提高了血糖水平。8小時后，魚類經歷了應激階段，肌肉收縮減少，活動水平下降。隨著魚類接近死亡，心臟功能惡化，導致血糖水平進一步下降。

呼吸頻率曲線表現出兩個明顯的趨勢：上升和下降。在最初的3小時內，由于魚類處于無水環境中，呼吸頻率增加，以更快地獲取氧氣。在3-7小時內，由于對低溫環境適應，呼吸頻率逐漸降低。在7-8小時的時間段內，呼吸頻率略微增加，可能是由于氧氣耗盡、呼出氣體積累和長時間暴露在無水環境中的原因。8小時后，隨著氧氣進一步消耗，魚類繼續在無水低溫環境中持續存在，呼吸頻率開始上升。在沒有水和寒冷的環境下，魚類逐漸失去活力，呼吸頻率持續下降。結合在3.2.1節中分析的電極斜率曲線，可以將鱸魚應激特征的變化劃分為五個明顯的階段（圖5b）。階段一：（0~3h）急性應激階段。個體進入無水低溫的新環境后產生了較為劇烈的生理應激反應。此時魚體增加了呼吸頻率和呼吸強度來維持正常的需氧量。階段二：（3~5h）體內調節階段。隨著個體對新環境運輸脅迫的逐漸適應，機體生理應激反應逐漸趨向平穩。階段三：（5~6h）適應應激階段。在10h適應了環境的鱸魚產生些許應激反應，身體出現些許應激的擺動。階段四：（6~8h）累積應激階段。進入應激期尾聲，鱸魚已經完全適應了運輸環境，因此其生理指標逐漸穩定，也意味著魚體處于深度休眠的狀態。階段五：（8~12h）瀕死階段。鱸魚度過應激期，肌肉不再頻繁收縮，其活動能力下降。同時呼吸困難，代謝率急劇下降。

圖 5：應激性能

將阻抗幅值，阻抗相位角輸入ANN模型，圖6的子圖左軸顯示了模型的預測結果。預測數據集由A1-A5樣本等距提取，目的是廣泛測試不同節點的數據。圖6a顯示了綜合因素影響下應激水平的預測結果，其具有鮮明的層次感，絕大部分預測等級均在真實值附近，只有少數數據點偏離整數值。圖6b和c分別顯示了以阻抗原始參數為輸入和以形態學特征參數為輸入的應激水平的預測結果，同樣具有鮮明的層次感，大部分預測等級均在真實值附近，但偏離整數值的數據點數明顯增多。值得一提的是，預測等級隨著時間的增長呈逐漸增加的趨勢，此時魚感到越來越不舒服，并可能增加運輸應激的概率或程度。

其中，鱸魚在 0-3h 和6.5-8h的運輸階段內，應激水平變化幅度較大，受到外界環境脅迫的影響最明顯，結合應激變化規律，應更多的在此階段對魚體應激水平進行干預及調節，以降低應激過激對魚體質量的影響。結合應激水平的變化趨勢可知，由于應激水平的累積作用，導致鱸魚的阻抗特性在較高的運輸脅迫下會隨應激水平的升高而逐漸降低，應控制運輸時間在8-10小時之內。模型的誤差在圖6的子圖右軸顯示。三種條件下數據的預測誤差都接近零值線，說明模型具有較強的泛化能力。特別的，當絕對誤差在0.3以內時，考慮綜合因子作用的預測精確度高達95.98%，高于單一環境因子預測模型（94.71%）和生理因子預測模型（95.02%）。但同時，仍有4組數據的預測誤差在1個等級以上，說明模型仍有待改進，但對整體預測精度影響不大。此外，預測集的預測精度與驗證集的預測精度較為接近，表明模型的適應能力較強。該評價模型為活魚的應激水平評價提供了參考。

圖 6：預測性能

★ 結論與展望

基于阻抗測量和數學建模方法，本文主要分析了無水低溫環境下鱸魚阻抗信息與鱸魚應激水平的關系，提出了鱸魚應激水平的預測方法。結果表明，片狀同側和銅材質的阻抗電極是持續監測鱸魚生理阻抗信息的最佳電極，基于ANN的應激水平預測模型的精度高達93.98%，因此，它被認為適合實際應用。試驗表明，隨著運輸時間的增長，鱸魚的應激水平持續升高，最后直至瀕死甚至死亡。試驗過程中，應更多的在在 0-3h 和6.5-8h的運輸階段內對魚體應激水平進行干預及調節，由于應激水平的累積作用，應控制運輸時間在8-10小時之內。未來的工作可以研究提高輸入/輸出信息量對模型結果的影響，例如增加電極數量和降低掃頻間隔，推動阻抗檢測技術的發展與實際應用。此外，將致力于提升預測模型的精度和穩定性，以更好的控制和降低因應激而死亡的概率。

審核編輯：黃飛