microRNA（miRNA）是一類短小的非編碼RNA分子，通常由20 ~ 24個核苷酸組成。它們通過干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯來調(diào)控基因表達。這種調(diào)控方式在細胞生物學、發(fā)育生物學和疾病發(fā)生發(fā)展等方面都具有重要意義。已經(jīng)有許多miRNA被證實其異常表達與糖尿病、心血管疾病和癌癥等疾病相關。因此，miRNA可作為特異性生物標志物參與疾病的診斷、預后與監(jiān)測。

迄今為止，已經(jīng)報道了許多檢測miRNA的生物傳感器。但由于miRNA在細胞和體液內(nèi)的豐度較低，生物傳感器往往需要與信號擴增策略相結合。其繁瑣的步驟和非可視化的結果限制了miRNA生物傳感器的廣泛使用，也影響了miRNA生物傳感器在實際樣本中的應用。

針對這一問題，吉林大學電子科學與工程學院董彪教授、口腔醫(yī)學院王林教授、物理學院李亮教授課題組合作，在國際化學權威雜志Biosensors and Bioelectronics上發(fā)表了以“Aversatile upconversion-based multimode lateral flow platform for rapid andultrasensitive detection of microRNA towards health monitoring”為題的相關工作。該研究針對miRNA的檢測開發(fā)了一種側(cè)流免疫傳感器，能夠同時產(chǎn)生比色、熒光以及拉曼信號。無需額外的信號擴增方式，傳感器可以在20分鐘內(nèi)檢測到miRNA，其檢測下限為1 fM。且該傳感器能夠應用在實際血清及唾液樣本中，并成功區(qū)分患者和健康對照組。

圖1 用于檢測microRNA的多模側(cè)流免疫生物傳感器示意圖及材料合成路線

在這項工作中，研究團隊開發(fā)了一種基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs，NaYF?: Yb3?,Er3?）的側(cè)流免疫傳感器。該傳感器能夠同時產(chǎn)生比色、熒光及拉曼信號。其系統(tǒng)原理及結構圖如圖1所示。將上轉(zhuǎn)換納米顆粒在試紙條T線上單層修飾，熒光信號的靈敏度得到了保證。

當待測樣品中含有目標miRNA時，結合墊上含有拉曼報告分子的金屬納米顆粒Au-DTNB@Ag與miRNA特異性結合。然后該復合體被T線上的核酸探針捕獲形成三明治結構。由于Au-DTNB@Ag在T線上的大量聚集，比色及拉曼信號增強，而熒光信號被猝滅。因此，這種基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒的多模側(cè)流免疫傳感器實現(xiàn)了對miRNA的特異性檢測。

上轉(zhuǎn)換納米顆粒的表征及信號增強策略如圖2所示。該傳感器熒光信號的低檢測下限主要來源于試紙條的纖維素結構。纖維素復雜的多孔狀結構不僅可以在單位面積下容納更多的熒光納米顆粒，同時上轉(zhuǎn)換納米顆粒的單層修飾保證了供體與受體的充分接觸。當試紙條干燥時，其內(nèi)部纖維素結構坍塌，進一步增進了供受體之間的距離，增加了靈敏度。此外，修飾在T線的熒光納米顆粒減小了試紙條的孔徑，同樣也使試紙條的靈敏度增加（圖2e ~ 2f）。

圖2 上轉(zhuǎn)換納米顆粒的形態(tài)結構、表征和性能

以miRNA-21為模版，研究人員對試紙條的檢測性能進行了考察，反應時間為20 min。隨著待測miRNA濃度的增加。試紙條的三種信號發(fā)生了變化。肉眼檢出限為10 pM，比色、熒光及拉曼檢測范圍分別為2 nM ~ 1 pM、1 nM ~ 1 fM和1 nM ~ 1 pM（圖3）。

圖3 側(cè)流免疫傳感器的應用性能評估

另外，為了減少使用步驟，量化使用條件，研究人員設計了熒光-拉曼雙檢測光路用來同時進行熒光-拉曼信號的檢測（圖4a）。在該光路下進行檢測，試紙條穩(wěn)定性、特異性均能得到保證（圖4b ~ 4f）。試紙條還可用于實際樣本檢測。在模擬體液樣本（圖4g）、真實唾液和血清樣本中均檢測到了信號的變化。可通過miRNA-155明確區(qū)分牙周炎患者和正常人（圖4h），并通過miRNA-21區(qū)分肺癌患者和正常人（圖4i）。其結果與RT-qPCR結果一致。

圖4 生物傳感器的應用性能評估和實際應用

綜上所述，本研究介紹了一種檢測體液中microRNA的多模側(cè)流免疫生物傳感器。通過在試紙條上組裝上轉(zhuǎn)換納米顆粒和核殼納米顆粒Au-DTNB@Ag，該傳感器可以同時產(chǎn)生熒光、比色和拉曼信號。將上轉(zhuǎn)換納米顆粒單層修飾在條帶上極大地增加了熒光檢測的靈敏度。使用 microRNA-21 作為分析物模型，該傳感器的檢測范圍在2nM ~ 1fM。

另外，該傳感器能夠應用在人工和真實體液樣本中。利用熒光-拉曼雙信號檢測光路，該系統(tǒng)可在20分鐘內(nèi)同時對多個信號進行定量檢測，為檢測體液中的miRNA提供了一種靈活的方法，也為側(cè)流免疫傳感器的開發(fā)提供了參考。

審核編輯：劉清