用于連續(xù)監(jiān)測生物分子濃度的傳感器對于在病人護(hù)理、工業(yè)流程以及環(huán)境安全和可持續(xù)性方面開發(fā)基于生化的監(jiān)測和控制策略是必需的。傳統(tǒng)的生物傳感器具有宏觀的感測區(qū)域，例如電極或光學(xué)探測的表面積，收集的信號源自大量分子集合的相互作用，而無法解析單分子層面的相互作用。近年來，傳感器已經(jīng)被微型化，并且開發(fā)出了由微型傳感器陣列組成的傳感器，其中每個(gè)單獨(dú)的傳感器都足夠小，能夠解析由單分子相互作用引起的轉(zhuǎn)變。本文用于研究由單分子分辨率傳感器陣列組成的連續(xù)傳感器中的功能異質(zhì)性，通過將傳感器暴露于分析物濃度變化（增加和減少）超過長時(shí)間跨度（25小時(shí)）。 該方法是一種基于數(shù)千個(gè)生物功能化粒子與生物功能化感測表面相互作用的連續(xù)生物傳感技術(shù)。揭示了異質(zhì)性是由粒子和表面上親和力分子數(shù)量的隨機(jī)波動(dòng)引起的，并且響應(yīng)特性的逐漸變化與單粒子傳感器中分子的逐漸損失有關(guān)。結(jié)果表明了顯著的分子和時(shí)間異質(zhì)性，并提供了如何為單分子分辨率的連續(xù)親和力基礎(chǔ)生物分子監(jiān)測設(shè)計(jì)、精確和穩(wěn)定的傳感器的思路。

近日，來自荷蘭埃因霍溫理工大學(xué)復(fù)雜分子系統(tǒng)研究所（ICMS）W. J. Prins團(tuán)隊(duì)，在《Advanced Science》雜志發(fā)表了題為“How Highly Heterogeneous Sensors with Single-Molecule Resolution can Result in Robust Continuous Monitoring Over Long Time Spans”的文章。該研究對具有單分子分辨率的生物分子傳感器由大量傳感器組成，這些傳感器測量與單分子結(jié)合和解離事件相關(guān)的態(tài)變化。傳統(tǒng)上，為了獲得足夠的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，會(huì)從許多單獨(dú)的傳感器中聚合信號。然而，通過聚合信號，傳感器之間的差異會(huì)丟失，異質(zhì)性也無法被研究。在這里，我們研究了長時(shí)間跨度內(nèi)具有單分子分辨率的傳感器，這使得可以從獨(dú)立的傳感器中收集足夠的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。這允許比較傳感器，揭示了它們分子組裝中與隨機(jī)變化相關(guān)的基本異質(zhì)性。該研究是通過粒子運(yùn)動(dòng)生物傳感進(jìn)行的，這是一種與數(shù)千個(gè)粒子動(dòng)態(tài)與感測表面相互作用的傳感方法。在25小時(shí)內(nèi)，對分析物濃度的一系列調(diào)制中，研究了單個(gè)粒子的信號。這些結(jié)果提供了對具有單分子分辨率的連續(xù)傳感器的分子和時(shí)間異質(zhì)性的見解，并解釋了如何設(shè)計(jì)傳感器以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健、精確和穩(wěn)定的生物分子監(jiān)測。 本文主要關(guān)注了如何在基本的單分子層面上研究、理解和利用基于親和力的傳感器的功能特性。將為實(shí)現(xiàn)能夠長時(shí)間跨度內(nèi)精確和穩(wěn)定監(jiān)測生物分子的傳感器的工程策略和設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)，以滿足廣泛的應(yīng)用需求。

圖1基于親和力的生物分子結(jié)合轉(zhuǎn)化為測量信號的傳感過程

傳感器分為三類：i) 基于集合的傳感器，ii) 具有單分子分辨率的傳感器組合，以及 iii) 具有單分子分辨率的單個(gè)傳感器探測。具有單分子分辨率的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法能夠區(qū)分和計(jì)數(shù)單個(gè)單分子結(jié)合和解離事件。劑量-反應(yīng)關(guān)系通常通過聚合單分子數(shù)據(jù)和許多單獨(dú)傳感器組合信號來建立。組合增加了測量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)量，然而，平均過程會(huì)導(dǎo)致關(guān)于異質(zhì)性的信息丟失，例如分子之間的差異、分子相互作用之間的差異以及傳感器之間的差異。 作者深入研究了具有單分子分辨率的傳感器之間的差異，以研究變異性并理解高度異質(zhì)性傳感器如何能夠在長時(shí)間跨度內(nèi)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健的連續(xù)監(jiān)測。BPM被用作模型系統(tǒng)（圖1B）。BPM是一種利用生物功能化的微米級粒子作為具有單分子分辨率的傳感器的生物傳感方法。粒子的運(yùn)動(dòng)特性受到粒子和感測表面之間可逆親和力單分子相互作用的影響。在實(shí)驗(yàn)中，粒子通過柔性的雙鏈DNA系繩附著在基質(zhì)上，將每個(gè)微米級粒子限制在傳感器表面上的亞微米級區(qū)域。使用寬場光學(xué)顯微鏡實(shí)時(shí)測量每個(gè)粒子的運(yùn)動(dòng)軌跡。 ? 圖2在BPM傳感器中探測單個(gè)粒子，以獲得25小時(shí)內(nèi)的單粒子響應(yīng) 本研究中使用的實(shí)驗(yàn)設(shè)置將粒子被固定在流動(dòng)池內(nèi)的表面上，該流動(dòng)池連接到一個(gè)定制的流體系統(tǒng)，用于長時(shí)間跨度的自動(dòng)化流體交換。作者使用了一個(gè)基于競爭的BPM傳感器進(jìn)行測量，該傳感器旨在連續(xù)監(jiān)測小分子（糖苷生物堿）。粒子與分析物類似分子的結(jié)合導(dǎo)致粒子的運(yùn)動(dòng)自由度減少，即粒子從未結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)換為結(jié)合狀態(tài)。粒子的視頻圖像被實(shí)時(shí)處理，以定位每個(gè)粒子的x和y位置作為時(shí)間的函數(shù)。然后分析運(yùn)動(dòng)軌跡以確定切換事件和粒子的相應(yīng)時(shí)間依賴狀態(tài)。10個(gè)分析物濃度-時(shí)間曲線系列在25小時(shí)內(nèi)順序應(yīng)用于單個(gè)流動(dòng)池，每個(gè)系列由8個(gè)不同分析物濃度的流體應(yīng)用組成。在每次流體應(yīng)用后跟蹤粒子15分鐘（圖2B）。在高分析物濃度下，活動(dòng)低，因?yàn)榱Ｗ又饕幱谖唇Y(jié)合狀態(tài)，因?yàn)榭贵w被分析物分子占據(jù)，很少與感測表面上的分析物類似物結(jié)合。黑色曲線顯示了粒子集合的平均響應(yīng)，與溶液中分析物濃度呈負(fù)相關(guān)，這符合基于競爭的傳感器的預(yù)期（圖2B）。有趣的是，單個(gè)粒子的響應(yīng)（紅色）顯示出高度的變化：不同的粒子顯示出明顯不同的行為。這些差異可能由時(shí)間和非時(shí)間異質(zhì)性引起。時(shí)間異質(zhì)性與單個(gè)粒子在結(jié)合和未結(jié)合狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換的時(shí)間點(diǎn)的隨機(jī)性有關(guān)。三個(gè)選定粒子的DRCs，分別為它們的第一個(gè)濃度系列（左）和所有十個(gè)濃度系列的時(shí)間平均（右）。根據(jù)粒子集合的平均響應(yīng)，一些粒子確實(shí)顯示出S形曲線，但令人驚訝的是，粒子也顯示出鐘形曲線（圖2C）。

圖3對具有不同數(shù)量的粒子端結(jié)合分子（NPSB）和基質(zhì)端結(jié)合分子 一個(gè)競爭性的基于粒子的傳感器被建模為具有NPSB（粒子端結(jié)合分子，PSBs）與溶液中的分析物分子以及感測表面上的NSSB（基質(zhì)端結(jié)合分子，SSBs）相互作用。顯示了不同數(shù)量的粒子結(jié)合分子和恒定數(shù)量的基質(zhì)結(jié)合分子（NSSB = 10）的模擬時(shí)間軌跡示例（圖3B）。突出顯示了兩個(gè)時(shí)間依賴的粒子屬性：PSBs和SSBs之間形成的鍵的數(shù)量（左y軸，紅色曲線）和觀察到的粒子狀態(tài)（右y軸，灰色曲線）。當(dāng)沒有PSB-SSB鍵時(shí)，粒子狀態(tài)為未結(jié)合，當(dāng)至少有一個(gè)PSB-SSB鍵時(shí)，粒子狀態(tài)為結(jié)合。圖3C顯示了單鍵時(shí)間分?jǐn)?shù)，即在只有一個(gè)PSB-SSB鍵時(shí)，粒子在單鍵狀態(tài)下花費(fèi)的平均時(shí)間分?jǐn)?shù)。對于少量的粒子端結(jié)合分子，隨著基質(zhì)端結(jié)合分子數(shù)量的增加，單鍵時(shí)間分?jǐn)?shù)增加。然而，對于大量的粒子端結(jié)合分子，由于形成了多個(gè)鍵，該分?jǐn)?shù)減少。圖3D顯示了對劑量-反應(yīng)關(guān)系的影響，粒子切換活動(dòng)繪制在y軸上。對于少量的結(jié)合分子，DRC呈現(xiàn)S形，并且隨著結(jié)合分子數(shù)量的增加，曲線向右移動(dòng)。

圖4利用信號-時(shí)間曲線的相位對單粒子響應(yīng)特性進(jìn)行分類

不同顏色表示不同的區(qū)間，在4A和4B兩個(gè)面板中均有顯示（圖4A，4B ）。數(shù)據(jù)顯示不同的相移區(qū)間與不同的DRC特征相關(guān)，從無響應(yīng)（暗紅色）到S形（橙色）到鐘形（綠色）。作者在本研究中，開發(fā)的分類方法可以研究粒子如何在長時(shí)間跨度內(nèi)改變它們的DRC特征。結(jié)果也顯示了粒子在25小時(shí)內(nèi)如何改變它們的DRC特征（圖4C，4D）。頂部面板與最初（在t = 0時(shí)）在面板A和B的橙色區(qū)間內(nèi)的粒子有關(guān)，在所有面板中，紅色曲線表示第一個(gè)DRC（在0到2.5小時(shí)之間測量），藍(lán)色曲線表示最后一個(gè)DRC（在22.5到25小時(shí)之間測量）。頂部面板的結(jié)果表明，最初具有S形DRC的粒子在25小時(shí)內(nèi)保持相同的DRC形狀和相同的相位偏移，而信號的幅度隨時(shí)間減少。底部面板顯示，最初具有鐘形DRC的粒子將其特征轉(zhuǎn)變?yōu)镾形DRC（具有較低的相位偏移）。具有鐘形DRC的粒子具有大量的結(jié)合分子和多價(jià)相互作用，因此失去結(jié)合分子將增加具有單價(jià)鍵的可能性，因此將DRC向S形特征轉(zhuǎn)移。 在粒子與表面之間的結(jié)合主要由單價(jià)鍵主導(dǎo)的區(qū)域中進(jìn)行的測量和模擬可以用來估計(jì)傳感器中結(jié)合分子的損失率。在單價(jià)結(jié)合區(qū)域，粒子具有S形DRCs，觀察到的活動(dòng)速度逐漸以每小時(shí)約1.6 ± 0.2%的速率減少（圖4C）。 文章鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202412181 ? ? ? 審核編輯 黃宇