圖 1.(a) CARS [3] 和 (b) 多路復(fù)用 CARS的能量示意圖，顯示接地、虛擬和振動(dòng)狀態(tài)。對(duì)于多路復(fù)用 CARS，通過(guò)用寬帶超連續(xù)脈沖代替窄帶斯托克斯光束來(lái)獲得多種振動(dòng)模式。

概述

流行的分子成像技術(shù)只能揭示人體內(nèi)用色素或熒光蛋白標(biāo)記的特定分子的分布或行為。然而，拉曼光譜允許研究人員通過(guò)光譜分析來(lái)識(shí)別未標(biāo)記分子的成分。因此，振動(dòng)(拉曼)光譜通常被稱(chēng)為分子指紋圖譜。使用這種無(wú)標(biāo)記分子成像增加了發(fā)現(xiàn)體內(nèi)意外變化和異常的可能性。

一種基于拉曼的創(chuàng)新技術(shù)，稱(chēng)為超多重 CARS 光譜成像，在實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用中展示了小型化、無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)和細(xì)胞級(jí)分子診斷的巨大實(shí)用性。這項(xiàng)技術(shù)能夠通過(guò)在寬光譜范圍內(nèi)同時(shí)收集的定量光子數(shù)據(jù)來(lái)觀察和分析生物結(jié)構(gòu)和過(guò)程，并且正在不斷改進(jìn)和改進(jìn)。

例如，日本筑波大學(xué)的 Hideaki Kano 副教授和他的同事最近對(duì)活細(xì)胞(18 種顏色對(duì)應(yīng) 18 個(gè)波數(shù))進(jìn)行了超多路 CARS 光譜成像，每像素的有效曝光時(shí)間為 1.8 毫秒，這是迄今為止報(bào)道的光譜覆蓋范圍~3000 厘米-1.2

CARS 基礎(chǔ)知識(shí)

相干反斯托克斯拉曼散射 (CARS) 得名于這樣一個(gè)事實(shí)，即這種非線(xiàn)性光譜技術(shù)不是使用傳統(tǒng)的單個(gè)激光器，而是利用一對(duì)非常強(qiáng)的相干激光束照射樣品，從而產(chǎn)生反斯托克斯頻率信號(hào)。雖然第一個(gè)激光器的頻率通常是恒定的，但第二個(gè)激光器的頻率可以調(diào)整，以使兩個(gè)激光器之間的頻率差等于感興趣的拉曼活性模式的頻率。這種特殊模式將是拉曼信號(hào)中唯一極強(qiáng)的峰。

CARS 比正常拉曼發(fā)射強(qiáng)幾個(gè)數(shù)量級(jí)。執(zhí)行 CARS 不一定需要光柵;如果寬帶干涉濾光片后面放置了檢測(cè)器，則可能會(huì)起作用。接下來(lái)介紹了 CARS 的數(shù)學(xué)和示意圖描述。參見(jiàn)圖 1a。

兩個(gè)頻率為哦1 和哦2(哦1>哦2 )相干相互作用以產(chǎn)生頻率較高的強(qiáng)散射光2 小時(shí)1-哦2.如果兩個(gè)激光器之間的頻率差 (哦1-哦2 ) 等于頻率哦m拉曼活躍的振動(dòng)、旋轉(zhuǎn)或其他模式，然后是頻率。

換句話(huà)說(shuō)，為了獲得強(qiáng)拉曼信號(hào)，應(yīng)以這樣的方式調(diào)整第二個(gè)激光頻率哦2= 哦1-哦m.那么強(qiáng)散射光的頻率將是2 小時(shí)1-哦2= 2 小時(shí)1- (哦1-哦m) = ω1+ 哦m，它高于激勵(lì)頻率。

除了克服大多數(shù)生物分子的低信號(hào)強(qiáng)度外，CARS 還提供定向發(fā)射和窄光譜帶寬，不受自發(fā)熒光的干擾。CARS 研究包括微生物細(xì)胞、真核細(xì)胞、捕獲細(xì)胞、醫(yī)學(xué)組織、上皮組織、肌肉組織、神經(jīng)組織、肺組織、乳腺組織、骨骼和皮膚。

CARS 顯微鏡的快速掃描功能對(duì)于研究實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)的研究人員來(lái)說(shuō)非常寶貴。此外，與熒光顯微鏡技術(shù)相反，細(xì)胞可以在 CARS 中重復(fù)成像，而不會(huì)因光漂白而出現(xiàn)褪色問(wèn)題。

多路復(fù)用 CARS 和超多路復(fù)用 CARS

多重 CARS(見(jiàn)圖 1b)是一種增強(qiáng)型 CARS 技術(shù)，它采用多通道檢測(cè)器(例如，科學(xué)級(jí) CCD 或 CMOS 相機(jī))與光譜儀耦合，以覆蓋相干拉曼信號(hào)的寬光譜范圍。

通過(guò)使用寬帶激光源(例如，超連續(xù)光源或飛秒激光源)代替可調(diào)諧激光 ω2，多路復(fù)用 CARS 信號(hào)的典型頻譜覆蓋范圍可以進(jìn)一步擴(kuò)展，達(dá)到約 3000 厘米-1.這種超多重 CARS 光譜成像方法足夠廣泛，可以檢測(cè)所有振動(dòng)基本模式——包括至關(guān)重要的指紋區(qū)域(在該區(qū)域可以識(shí)別未知有機(jī)化合物并相互區(qū)分)以及 C-H 和 O-H 拉伸區(qū)域(有助于識(shí)別脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的粗略分子分布)。

新的超多重 CARS 實(shí)驗(yàn)

2000 年春天，當(dāng) Hideaki Kano 博士作為博士生參加在舊金山舉行的 CLEO 會(huì)議時(shí)，他被使用光子晶體光纖生成超連續(xù)譜所吸引，這種光纖只需要飛秒激光振蕩器即可產(chǎn)生超連續(xù)譜 (SC)。后來(lái)，在東京大學(xué)的濱口實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始了他的學(xué)術(shù)生涯后，他開(kāi)發(fā)了一種利用 SC 生成的國(guó)產(chǎn)逆拉曼光譜系統(tǒng)(現(xiàn)在通常被稱(chēng)為受激發(fā)拉曼損耗或 SRL)光譜系統(tǒng)。

在他的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，Kano 博士碰巧發(fā)現(xiàn)了 CARS 信號(hào)，它非常強(qiáng)烈，實(shí)際上比反向拉曼(即 SRL)信號(hào)更容易檢測(cè)。他很快意識(shí)到，將 SC 生成與光譜儀相結(jié)合不僅在基礎(chǔ)光譜學(xué)領(lǐng)域，而且在光譜成像剛剛興起的生命科學(xué)領(lǐng)域也將是一個(gè)突破。

實(shí)驗(yàn)裝置

Kano 博士的實(shí)驗(yàn)裝置中集成了兩個(gè)激光源，以及具有超高 NIR 靈敏度的新型高讀出速度 CCD 相機(jī)和高通量光譜儀。參見(jiàn)圖2。

第一個(gè)基于主振蕩器光纖放大器 (MOFA) 配置的激光源涉及一個(gè)微芯片振蕩器——一種包含 Nd：YVO 的無(wú)源 Q 開(kāi)關(guān)激光器4晶體與可飽和吸收鏡和摻鐿光纖放大器鍵合。第二個(gè)來(lái)源是無(wú)源 Q 開(kāi)關(guān)微芯片 Nd：YAG 激光器。研究人員能夠根據(jù)所研究的樣品類(lèi)型切換激光源，從而在波長(zhǎng)、時(shí)間持續(xù)時(shí)間、重復(fù)頻率和輸出平均功率方面提供良好的實(shí)驗(yàn)靈活性。

圖 2.超多重光譜 CARS 系統(tǒng)。禮貌筑波大學(xué) Hideaki Kano 博士;改編自 OSAContinuum， 1693-1705 (2019)。

與 Kano 博士和他的同事在之前對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行超多重 CARS 光譜成像研究時(shí)使用的最先進(jìn)的 CCD 相機(jī)相比，新推出的科學(xué) CCD 相機(jī)提供的 NIR 靈敏度要高得多。

除了在重要的 NIR 活體成像波長(zhǎng)下具有更高的靈敏度外，這款新相機(jī)還提供了與 Kano 博士時(shí)間分辨研究中使用的超快激光器同步所需的高速操作。研究人員將相機(jī)與高通量光譜儀耦合，該光譜儀分散鏡頭收集的 CARS 信號(hào)以供相機(jī)檢測(cè)。

在用于對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行成像之前，首先通過(guò)測(cè)量聚苯乙烯珠(直徑：10 μm)的 CARS 信號(hào)來(lái)評(píng)估實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。在 600 cm 范圍內(nèi)檢測(cè)到微珠的超多重 CARS 信號(hào)-1至 3600 厘米-1跟分辨率 <10 cm-1.像素停留時(shí)間為 ~1 毫秒，從微珠中采集了 161 × 161 個(gè)像素的 CARS 圖像，總數(shù)據(jù)采集時(shí)間為 ~28 秒(圖 3)。

圖 3.苯環(huán)呼吸振動(dòng)模式下的 CARS 圖像 (1003 cm-1)在不同的深度位置;圖像是利用被動(dòng)Q 開(kāi)關(guān)微芯片 Nd：YAG 激光器和 CCD 相機(jī)獲得的。分辨率為161 × 161 像素，總數(shù)據(jù)采集時(shí)間為 ~28 秒，盡管使用低成本的 Microchip 激光源。2由 Tsukuba 的 Hideaki Kano 博士提供大學(xué);首次發(fā)表于 OSA Continuum 2，1693-1705 (2019)。

活 A549 細(xì)胞的成像

在通過(guò)對(duì)聚苯乙烯珠子進(jìn)行成像驗(yàn)證系統(tǒng)的性能后，研究人員使用高速、高靈敏度的 CCD 相機(jī)和 MOFA 激光源對(duì)活細(xì)胞 (A549) 進(jìn)行了成像(圖 4)。在2850 厘米-1在光譜上，以紅色渲染的亮點(diǎn)對(duì)應(yīng)于單元內(nèi)的一個(gè)亮點(diǎn)，而該亮點(diǎn)又對(duì)應(yīng)于中文2拉伸振動(dòng)模式主要在細(xì)胞內(nèi)脂滴中觀察到。請(qǐng)注意，原始 CARS 信號(hào)由振動(dòng)諧振信號(hào)和非諧振背景組成。這兩個(gè)組件相互干擾并產(chǎn)生分散的線(xiàn)形。

圖 4.(a) A549 細(xì)胞的光學(xué)圖像;(b) 2850 cm 處的 CARS 強(qiáng)度映射-1;(c) 在 (b) 中的兩個(gè)位置使用紅色和藍(lán)色叉表示的原始 CARS 信號(hào)的頻譜分布。圖像是使用 MOFA 激光源獲得的和 CCD 相機(jī)。由筑波大學(xué)的 Hideaki Kano 博士提供;第一發(fā)表于 OSA Continuum 2，1693-1705 (2019)。

接下來(lái)，Kano 博士和他的同事通過(guò)進(jìn)行數(shù)值分析提取純振動(dòng)共振信號(hào)，以獲得自發(fā)拉曼等效光譜圖。他們發(fā)現(xiàn)這些所得光譜圖譜的主要特征分別與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的主要特征非常一致。十幾個(gè)特征拉曼帶之間3427 厘米-1和 1009 厘米-1對(duì)應(yīng)于振動(dòng)模式。

有關(guān)本研究的其他數(shù)據(jù)和更詳細(xì)的討論，請(qǐng)參閱以下文章：Hideaki Kano、Takumi Maruyama、Junko Kano、Yuki Oka、Daiki Kaneta、Tiffany Guerenne、Philippe Leproux、Vincent Couderc 和 Masayuki Noguchi，“具有 1 毫秒像素停留時(shí)間的超多路復(fù)用 CARS 光譜成像”，OSA Continuum 2,1693-1705 (2019)。

進(jìn)展與展望

研究人員進(jìn)行了超多重 (600 cm-1- 3600 厘米-1) 對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行 CARS 光譜成像，報(bào)告了光譜范圍為 ~3000 cm 的寬帶 CARS 迄今為止的最快時(shí)間-1.基于清晰的分子指紋，Kano 博士和他的同事可視化了具有超過(guò) 15 個(gè)振動(dòng)帶的細(xì)胞內(nèi)分子分布。在軟件上 1 毫秒的曝光時(shí)間相當(dāng)于每個(gè)像素的有效曝光時(shí)間為 ~1.8 毫秒，與 Kano 博士之前關(guān)于活細(xì)胞成像的研究(其中每個(gè)像素的曝光時(shí)間為 50 毫秒)相比，這是一個(gè)顯著的減少。這種改進(jìn)主要?dú)w功于新推出的 CCD 相機(jī)更高的靈敏度和讀出速度。2,7

這種高速技術(shù)與多變量分析方法的結(jié)合可以幫助生命科學(xué)家和醫(yī)生獲得對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝活動(dòng)動(dòng)態(tài)的有意義的見(jiàn)解。Kano 博士的研究小組目前正在與一名病理學(xué)家合作，使用分子指紋開(kāi)發(fā)一種新的光譜診斷工具。

關(guān)鍵技術(shù)

為了促進(jìn)他們最近的工作，研究人員選擇了Teledyne 普林斯頓儀器 BLAZE?相機(jī)采用專(zhuān)有的“超深耗盡型”CCD，由高電阻率塊狀硅制成8.該相機(jī)旨在產(chǎn)生任何可用硅器件中最高的近紅外量子效率，采用背照式 1340 x 400 光譜陣列格式(20 μm 方形像素)，能夠在空氣中冷卻至 -95°C，無(wú)需冷卻器或液體輔助，可實(shí)現(xiàn)低暗電流性能。

BLAZE 還為研究人員提供了 CCD 相機(jī)中最快的 ADC 速度。新傳感器平臺(tái)的雙 16 MHz 讀出端口經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)，可在完全垂直合并的情況下實(shí)現(xiàn)前所未有的超過(guò) 1600 個(gè)光譜/秒的光譜速率，在動(dòng)力學(xué)模式下運(yùn)行時(shí)高達(dá) 215 kHz。

與 BLAZE 相機(jī)配合使用的光譜儀是 Teledyne Princeton Instruments LS-785。由于其快速 f/2 光學(xué)系統(tǒng)和專(zhuān)有的 AR 涂層鏡頭可實(shí)現(xiàn)最佳近紅外透射，LS-785 可以實(shí)現(xiàn)高達(dá) 4 倍的標(biāo)準(zhǔn) f/4 反射光譜儀的吞吐量。CCD 相機(jī)和基于鏡頭的光譜儀的所有功能和定時(shí)均在實(shí)驗(yàn)裝置中通過(guò) Teledyne 普林斯頓儀器 LightField?64 位軟件。

審核編輯 黃宇