工程微生物相互作用的工具包

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資料介紹

描述

項目概況

復雜群落中細胞之間的相互作用會導致出現超出簡單細胞單一培養所能達到的意想不到的功能行為。在利用細胞群落推進一系列合成生物學應用（從生物材料到更高效的細胞工廠）方面存在巨大的未開發潛力。我們正在構建一個工具包，用于系統地設計兩種細胞類型的混合種群之間可能發生的結構和生態相互作用。我們的工具包將提供兩種人工表面受體，用于構建大腸桿菌之間粘附相互作用的組合以及用于在細胞之間產生協同和對抗生態關系的模塊化電路。借助這組相互兼容且具有功能特征的部件，我們將為科學家、教育工作者和基于社區的實驗室提供開放且可訪問的資源，以開始對多細胞細菌群落進行編程。

生物積木

為了設計具有明確相互作用的細菌系統，我們利用了 3 個主要的生物“構建塊”。這些是 1) 編碼蛋白質的合成基因，這些蛋白質允許細胞選擇性地識別和結合其他細胞（稱為“納米抗體”），2）不能自行產生某些必需營養素的基因突變細菌菌株（稱為“營養缺陷型”）， 3) 稱為質粒的便攜式 DNA 元件，可產生抗菌毒素并對這些毒素產生選擇性免疫。

納米抗體粘附受體

我們有幾種用質粒轉化的細菌菌株，這些質粒編碼納米抗體-抗原對。這些納米抗體蛋白在已用適當質粒成功轉化的細菌細胞表面表達。其他細菌細胞如果用合適的質粒轉化，它們的細胞表面會顯示抗原。

納米抗體將以高特異性和親和力結合特定的表面抗原，因此顯示互補納米抗體-抗原對的不同細胞將相互粘附并形成團塊。這些細胞還標記有不同的熒光蛋白，因此可以在顯微鏡下檢測分析新興結構。

營養缺陷型突變體

我們有 8個大腸桿菌突變體，它們對 4 種不同的氨基酸（色氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和異亮氨酸）呈營養缺陷型，并帶有 eGFP 或 mCherry 標記。

每個營養缺陷型將無法生長，除非它所在的培養基補充了相關的氨基酸，并且這些營養缺陷型的生長可以通過它們的熒光（在顯微鏡下的讀板器中）或通過觀察濁度來檢測（在讀板器或分光光度計中）。

氨基酸會擴散出大腸桿菌細胞，因此同一環境中的不同營養缺陷型可能能夠彼此共享資源，從而在沒有補充氨基酸的培養基中維持生長。這可用于生成互惠交互對。

毒素-抗毒素系統

細菌已經進化出可以分泌毒素的自然系統，毒素是用來殺死其他細胞的大分子。可以用編碼產生毒素-抗毒素對的質粒轉化細菌，從而賦予產生毒素的細菌對毒素的抗性。這些釋放到周圍介質中的毒素會傷害沒有抗毒素的其他細菌，從而在細胞之間產生對抗性的社會相互作用。

結果（截至2019.10.30）

設置突變菌株的生長條件

我們首先必須調整生長條件，以便營養缺陷型突變體大腸桿菌在我們的工具包中將無法自行增長，除非媒體得到補充。在碳源有限的嚴格培養基配方上未能看到任何生長后，我們在添加 0.4% 葡萄糖的 M9 基本培養基中看到了合理的生長。我們可以通過補充過量（即 100 ug/mL）各自的氨基酸來挽救蛋氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和色氨酸營養缺陷型的生長（圖 1A）。在補充和未補充的平板上，我們證實其他氨基酸不能替代我們的任何營養缺陷型，并且觀察到的生長不僅僅是來自污染（圖 1B）。為了觀察這些影響，我們必須接種相對少量的細菌 (<3 uL)。更高的接種量導致突變體在所有培養基條件下的非特異性生長，

建立營養缺陷型共生培養物

在驗證了我們的營養缺陷型菌株的功能特性后，我們接下來將成對的菌株混合在一起，以確定在其他情況下無法存活的菌株在混合時是否可以通過互惠相互作用恢復彼此的生長能力。我們發現這些實驗對起始細胞數量、生長培養基進入最小培養基共培養室的殘留以及每個營養缺陷型的生存能力差異非常敏感。然而，我們能夠在某些營養缺陷型對之間建立強烈的互惠互作，包括 - 蛋氨酸和 - 異亮氨酸對的生長，以及 - 異亮氨酸和 - 異亮氨酸等相同背景的營養缺陷型不生長（圖 2）。

不同營養缺陷型突變體自身（綠色和橙色）和混合在一起（藍色）的生長曲線

測量基因組編碼的熒光標簽

為了區分我們正在共同培養的菌株，我們選擇了在基因組中集成了不同熒光蛋白標記的兼容菌株（mCherry 用于紅色熒光，eGFP 用于綠色熒光）。我們將這些菌株的載玻片和陰性對照（非熒光）和陽性對照（已知熒光）細菌以不同密度放在落射熒光顯微鏡下。我們發現稀釋密度會導致分散的單細胞（與團塊或堆疊相反）和視野中的大量細胞（與細胞太少無法分析的稀疏視圖相反）。校準陽性對照的顯微鏡設置后，我們在所有 eGFP 和 mCherry 標記的菌株上看到了清晰的熒光信號。然而，我們也經歷了極快的光漂白，信號在照明后幾秒鐘內消失到無法檢測到的水平。盡管我們測試的幾種抗褪色封片劑都不能解決這個問題，但我們能夠將熒光壽命延長數秒，足以對細胞進行仔細成像（圖 3）。

我們細菌菌株的顯微鏡圖像

驗證納米體粘附菌株

我們建立了一個協議，用于將我們的粘附質粒引入我們許多不同的標記和營養缺陷型大腸桿菌背景，而無需通常的細菌轉化第一步，即首先使細胞具有能力。我們基于電穿孔的方案在從眾多菌株中制造轉基因細菌方面節省了大量時間，并且具有避免使用冷藏離心機等設備和使用像我們這樣的許多社區實驗室空間無法使用的快速冷凍的額外好處。

使用此協議，我們生成了帶有粘附質粒和熒光標簽的菌株，以及一小部分帶有粘附質粒的營養缺陷型。在轉化之前，我們對所有粘附質粒進行了 Sanger 測序，以驗證每個構建體與預期序列完全匹配。這一點特別重要，因為一些肽只有 4 個氨基酸長，否則很難檢測到錯誤。

我們已經開始測試用于編程物理交互的一組表面展示的納米抗體和抗原對。通過簡單的結塊測定，我們可以觀察到細菌與結合的納米抗體-抗原組混合的培養物的濁度略有變化，這是由于結合細胞聚集成可以沉淀的致密團塊。我們已經看到了三個粘附對中的一個的令人鼓舞的初步結果（圖 4A）。在納米抗體表達細胞和成對的抗原表達細胞的混合物的三個重復中的兩個，在第一個小時內出現了顯著的結塊，而沒有納米抗體匹配的對照沒有顯著結合（圖 4B）。

具有誘導的納米抗體相互作用的細胞聚集

與毒素/抗毒素系統的拮抗相互作用

我們還設計了一種質粒，用于產生分泌毒素的細菌，它們自身通過抗毒素的內部表達對其免疫（圖 5）。我們為這種毒素-抗毒素質粒選擇了大腸桿菌素 E1，并在可誘導的阿拉伯糖啟動子的調控下能夠滴定毒素水平，從而可以發生有趣的生態相互作用，例如 amensalism，而不會強到沒有抗毒素的細胞不能成長和互動。到目前為止，我們已經提取了最終質粒組裝所需的一半部分，并將使用我們已建立的生長測定法克隆和測試質粒。

毒素-抗毒素表達質粒示意圖

顯微鏡下的共培養表型

在我們準備和驗證了大部分基礎菌株后，我們開始描述相互作用細胞的共培養物如何在微觀水平上出現。作為第一個例子，我們采用相互依賴的營養缺陷型突變體，讓它們一起建立穩定的生長。一個突變體我們標記為綠色 (eGFP)，另一個標記為紅色 (mCherry)。將細胞從我們的培養板轉移到顯微鏡載玻片上后，我們可以在廣角熒光顯微鏡下觀察不同的細胞群（圖 6A）。可以從我們的共培養圖像中提取大量表型，例如細胞鄰近性、比率和定位（圖 6B）。雖然我們還沒有開始全面探索這些對我們成像數據的潛在分析，但我們打算研究量化共培養圖像的方法。

營養缺陷型細菌的共培養

如何使用我們的微生物工具包

對于有興趣嘗試我們的工具包的最終用戶，我們在此處提供了一個示例來說明該工具包的工作原理以及我們提供的相應協議和資源。在其最終形式中，用戶將收到我們為工具包中的每種大腸桿菌菌株準備的冷凍甘油原液等分試樣。這些菌株包括具有營養缺陷型突變、誘導毒素/抗毒素質粒以及表面展示的納米抗體和抗原的不同組合的細菌。每個菌株在其基因組中都有一個綠色或紅色熒光標記，以便在實驗中輕松識別。

通過將兩種菌株混合在一起，用戶可以建立一個明確的雙細胞類型群落。我們的協議涵蓋了將細菌種群培養成培養物所需的所有基本必要信息，以及在微量滴定板上混合菌株以進行基于平板的實驗的方法。遵循這些協議，即使對于營養缺陷型突變體，我們也能夠可靠地獲得適當的生長行為。重要的是，這些準則允許觀察到互利共生的相互作用。

還提供了使用我們的表面粘附蛋白誘導細胞聚集的方案。一旦我們的毒素/抗毒素系統完成，我們還將獲得校準誘導水平以獲得穩定的拮抗相互作用的說明。我們還有一個使用熒光標簽監測共培養細菌生長的程序，這對生態相互作用特別有用。用于分析增長數據的 Python 代碼與我們的協議一起提供。

這些協議中的任何一個都可以用來單獨描述給定的共文化。我們還有準備細胞樣本以在顯微鏡下觀察的方案，我們希望這將成為用戶在微生物群落復雜性不斷增加的水平上進行探索的特別有趣的觀察來源。

外表

我們希望盡快完成組裝構成我們交互工具箱的粘附菌株和突變菌株。我們正在努力優化的協議將是該工具包的另一個關鍵組成部分，因此其他人可以輕松建立適當的培養條件來觀察有趣的生物學效應。

我們的工具包有許多潛在的應用。首先，它可能會用作一種教育資源，以通過易于查看的讀數顯示簡單設置中的微生物相互作用。其次，它們可以成為在還原論框架下研究微生物相互作用的研究工具。復雜細胞自組裝的可能性特別有趣，并且有來自其他人的數據支持其合理性。第三，混合細胞群之間的穩定相互作用可用于優化生物反應器，超出單一培養所能達到的范圍。最后，能夠對這些相互作用進行編程可以將細胞轉變為用于生產圖案化生物材料的支架。通過我們作為 Biomaker Challenge 的一部分的工作以及我們作為劍橋大學合成生物學協會的學生的項目，