步驟1：選擇3D打印機(jī)

我們選擇Monoprice MP Select Mini 3D打印機(jī)V2作為起始3D打印機(jī)。之所以被選中，是因?yàn)樗哂械统杀竞透呖捎眯浴Ａ硗猓呀?jīng)有一個(gè)高度精確的打印機(jī)3D模型，這使得設(shè)計(jì)更容易。這個(gè)可以為這個(gè)特定的打印機(jī)量身定制的b。類似的過程可用于轉(zhuǎn)換其他常見的FDM打印機(jī)和CNC機(jī)器。

第2步：3D打印

在拆卸Monoprice打印機(jī)之前，需要3D打印幾個(gè)部件才能修改3D打印機(jī)。有糊狀擠出機(jī)的版本，一個(gè)需要環(huán)氧樹脂，另一個(gè)不需要環(huán)氧樹脂。需要環(huán)氧樹脂的那種更緊湊但更難以組裝。

步驟3：準(zhǔn)備打印機(jī)進(jìn)行修改

前塔板，底蓋和控制面板應(yīng)該是除去。卸下底部后，斷開控制板上的所有電子設(shè)備，然后卸下控制板。

第4步：可互換掛載

主體1和主體14均需要兩個(gè)熱定形螺母。機(jī)身1通過隱藏在皮帶下方的兩個(gè)M3螺栓安裝在打印機(jī)機(jī)架上。通過拆下皮帶張緊器并將皮帶拉向一側(cè)可以顯示螺栓。

步驟5：Z軸開關(guān)

重新定位Z軸開關(guān)任何長度的針都可以在歸位序列中使用而無需在軟件中進(jìn)行補(bǔ)償。開關(guān)應(yīng)使用2個(gè)M3螺釘安裝在打印機(jī)底盤的正下方，盡可能靠近打印床。

步驟6：接線

接線已完成符合Ramps 1.4標(biāo)準(zhǔn)。只需按照接線圖。根據(jù)接線端子的需要切斷錫線。某些電線可能需要延長。

步驟7：環(huán)氧樹脂擠出機(jī)

雖然這臺擠出機(jī)的印刷時(shí)間較短，但它確實(shí)使用了環(huán)氧樹脂，這使得總生成時(shí)間增加到24小時(shí)以上。 8mm螺紋桿應(yīng)該環(huán)氧化到608軸承，軸承應(yīng)該環(huán)氧化到3D打印件主體21.此外，螺紋桿的螺母應(yīng)該環(huán)氧化到主體40.一旦環(huán)氧樹脂完全固化，橡膠來自60ml和10ml注射器柱塞的尖端可分別安裝在主體9和主體21上。找不到合適的T型接頭，因此粗制的T型接頭由6mm黃銅管和焊料制成。擠出機(jī)用作液壓系統(tǒng)，將Bioink推出10ml注射器的下腔室。通過在將T形接頭保持在最高點(diǎn)的同時(shí)劇烈搖動管子，可以將空氣排出系統(tǒng)。

步驟8：常規(guī)糊狀擠出機(jī)

此擠出機(jī)可以簡單地用螺栓固定在一起。這臺擠出機(jī)的缺點(diǎn)是體積更大，后沖量大。

步驟9：Arduino固件

Arduino需要固件來運(yùn)行步進(jìn)驅(qū)動程序和其他電子設(shè)備。我們之所以選擇Marlin是免費(fèi)的，可以使用Arduino IDE輕松修改并得到很好的支持。我們已經(jīng)為我們的特定硬件修改了固件，但是對于其他打印機(jī)進(jìn)行修改非常簡單，因?yàn)樗写a都經(jīng)過評論和清楚解釋。雙擊MonopriceV2BioprinterFirmware.ino文件以打開marlin配置文件。

步驟10：Cura配置文件

可以將Cura配置文件導(dǎo)入U(xiǎn)ltimaker Cura 4.0.0并用于制作高表面積網(wǎng)以用于大量反應(yīng)器。為打印機(jī)生成Gcode仍然具有很高的實(shí)驗(yàn)性，需要很大的耐心。還附有用于圓形灌注反應(yīng)器的測試gcode。

步驟11：更改開始G代碼

將此代碼粘貼到開始G代碼設(shè)置中：

G1 Z15

G28

G1 Z20 F3000

G92 Z33.7

G90

M82

G92 E0

在Repetier中，要修改啟動Gcode，請轉(zhuǎn)到切片器 - 》配置 - 》 G代碼 - 》啟動G-代碼。必須修改每個(gè)特定情況的G92 Z值。慢慢增加該值，直到針在打印開始時(shí)距離培養(yǎng)皿表面所需的距離。

步驟12：制作Bioink

開發(fā)適合應(yīng)用的Bioink的過程很復(fù)雜。這是我們遵循的過程：

總結(jié)

水凝膠適用于對剪切敏感的植物細(xì)胞并且已經(jīng)打開大孔允許擴(kuò)散。通過將瓊脂糖，藻酸鹽，甲基纖維素和蔗糖溶解在去離子水中并添加細(xì)胞來制備水凝膠。凝膠是粘性的，直到用0.1M氯化鈣固化，這使其堅(jiān)固。氯化鈣固化溶液與藻酸鹽交聯(lián)以使其堅(jiān)固。藻酸鹽是凝膠的基質(zhì)，甲基纖維素使凝膠均勻化，瓊脂糖提供更多的結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗谑覝叵履z化。蔗糖為細(xì)胞提供食物以繼續(xù)在水凝膠中生長。

驗(yàn)證凝膠的一些實(shí)驗(yàn)的簡要概述

我們用不同量的瓊脂糖測試了不同的水凝膠，記錄了它的稠度，打印的容易程度，以及它是否在固化溶液中沉淀或漂浮。降低藻酸鹽百分比使凝膠過于流動，并且在印刷后無法保持其形狀。增加藻酸鹽百分比使得固化溶液如此快速地起作用，凝膠在粘附到頂層之前會固化。使用2.8wt％的藻酸鹽開發(fā)保持其形狀并且不能太快固化的水凝膠。

如何開發(fā)水凝膠

材料

瓊脂糖（0.9 wt％）

海藻酸鹽（2.8wt％）

甲基纖維素（3.0重量％）

蔗糖（3.0重量％）

氯化鈣.1M（147.001 g/mol）

ddH20

細(xì)胞聚集體

2個(gè)洗過的和干過的燒杯

1混合刮刀

鋁箔

塑料稱重紙

刻度圓筒

程序

制作水凝膠：

根據(jù)您想要制備的凝膠溶液量，測量出特定量的ddH20。使用量筒獲得特定體積的ddH20。

水凝膠溶液含有藻酸鹽（2.8wt％），瓊脂糖（0.9wt％），蔗糖（3wt％）和甲基纖維素（3wt％）。使用塑料稱重紙測量水凝膠溶液的適當(dāng)部分組分。

稱量完所有成分后，將ddh20，蔗糖，瓊脂糖，最后加入海藻酸鈉加入其中一個(gè)干燒杯中。旋轉(zhuǎn)混合，但不要使用刮刀混合，因?yàn)榉勰⒄吃诠蔚渡稀?/p>

混合后，用鋁箔正確包裹燒杯頂部并標(biāo)記燒杯。在箔的頂部添加一片高壓滅菌帶。

將剩余的甲基纖維素放入另一個(gè)干燥的燒杯中，并將其包裹在鋁箔中，如同之前的燒杯一樣。標(biāo)記此燒杯并在箔的頂部添加一片高壓滅菌帶。

用鋁箔包裹1個(gè)刮刀，確保沒有任何刮刀暴露在鋁箔中。將高壓滅菌帶添加到包裹的刮刀中。

在滅菌周期中，將121個(gè)燒杯和1個(gè)刮刀在121℃下高壓滅菌20分鐘。不要在無菌和干循環(huán)中使用AUTOCLAVE。

高壓滅菌循環(huán)完成后，讓凝膠冷卻至室溫，一旦達(dá)到它，開始在生物安全柜中操作。

在生物安全柜中操作后，務(wù)必洗手和使用適當(dāng)?shù)臒o菌技術(shù)。還要確保不要直接接觸接觸凝膠或接近凝膠的物體（例如：刮刀的混合端，或凝膠上的鋁箔區(qū)域）

在生物安全柜中將甲基纖維素混合到凝膠中以獲得均勻的涂抹。完成混合后，將混合凝膠溶液頂部重新包裹并放入冰箱中過夜。

從這里凝膠可用于引入細(xì)胞或用于其他用途，如印刷。。

添加單元格：

過濾單元格它們的大小相同。我們的過濾程序是

輕輕刮掉培養(yǎng)皿上的細(xì)胞，用380微米的篩子過濾細(xì)胞。

使用平頭刮刀輕輕混合水凝膠溶液中的過濾細(xì)胞，以避免混合物丟失（經(jīng)過高壓滅菌）。

混合后，細(xì)胞離心出氣泡

從這里開始，水凝膠已經(jīng)完成，可用于印刷，固化和未來的實(shí)驗(yàn)。

如何開發(fā)固化液（0.1M氯化鈣，CaCl2）

材料

氯化鈣

ddH 2 O中

蔗糖（3 wt％）

程序（制備1L固化溶液）

測量147.01g氯化鈣，30mL蔗糖和1L ddH 2 O.

在大燒杯或容器中混合氯化鈣，蔗糖和ddH20。

將凝膠浸入固化液中至少10分鐘即可固化。

步驟13：打印！

理論上，Bioprinting是非常簡單;然而，在實(shí)踐中，有許多因素可能導(dǎo)致失敗。使用這種凝膠，我們發(fā)現(xiàn)可以采取一些措施來最大限度地提高我們的應(yīng)用效果：

使用少量CaCl2溶液在印刷時(shí)部分固化凝膠，

在培養(yǎng)皿底部使用紙巾以增加附著力

使用紙巾在整個(gè)打印件上均勻涂抹少量CaCl2

在Repetier中使用流速滑塊找到正確的流速

對于不同的應(yīng)用和不同的凝膠，可能需要使用不同的技術(shù)。我們的程序產(chǎn)生了幾個(gè)月。耐心是關(guān)鍵。