傳統的組織病理學處理組織包括固定、包埋、切片和染色等過程,會導致所得圖像變形偽影且某些生物信息缺失,這對于醫生對圖像的觀察和解釋都會造成影響,并且這個過程會耗費大量的時間。

對于非線性光學顯微鏡,通過不同的激發光能實現不同的非線性成像過程,不同的非線性成像過程是由生物樣品中不同的內源性生物分子引起的,這就說明不同的激發光能夠“人工”的標記各種內源性生物分子,而不需要外源性染色劑或其他熒光劑進行“物理”標記,并且這些非線性成像過程都可以在實現CARS的多模態系統中實現。

圖1中的三個系統都是比較常見的CARS顯微鏡系統,這些系統存在兩個問題:第一,圖中固體激光器直接出射的激光(“紅色”光束)打到顯微鏡系統里,激光器的光束指向隨時間和溫度可能會漂移,指向不穩定性容易受到日常變化的影響,直接影響顯微鏡系統的成像,所以需要經常對進入顯微鏡的光束進行重新對準。

圖1c中激光器出射的光束通過分束器分為兩路,下面那路通過光子晶體光纖產生超連續譜(“綠色”光束),此時激光源的光束漂移只會影響到激光束與光子晶體光纖的耦合,進而影響從光纖中出射的超連續譜的能量,而不會直接影響后面的顯微鏡系統,但分束后上路的“紅色”光束仍存在上面描述的問題。第二,實現CARS的多模態系統如何選擇光源是一個需要考慮的問題,多模態系統通常需要飛秒脈沖來激發多光子熒光、諧波生成等過程,但是飛秒脈沖光譜較寬,用于CARS成像時遠大于大多數分子振動特征峰的尺度(10cm-1), 使得CARS的光譜分辨率較低,所以CARS顯微鏡一般使用皮秒激光器作為光源來獲得較高的光譜分辨率。

圖1 常見的CARS顯微鏡系統

2016年,Haohua Tu等人提出的無標記的多模態非線性成像系統比較好的解決了上面的兩個問題,具體光路圖如圖2,光源為Yb: KYW激光器(1,041 nm, 220 fs, 80 MHz),使用一種保偏的全正色散的光子晶體光纖產生寬帶單模超連續譜(780-1320 nm),光子晶體光纖放到激光器的后面、分束器的前面,這樣就能保證分束后的兩條光路都不會由于激光源的光束漂移而導致這兩條光路的光束指向不穩定,進而影響后面的顯微鏡系統。

激光源的光束漂移只會影響到激光束與光子晶體光纖的耦合,為了減小這種影響,又使用反饋控制回路將光子晶體光纖的輸出(輸入)耦合功率保持在480 mW (800 mW)。接著通過離軸拋物面鏡對輸出的超連續譜進行準直,又通過二向色鏡將光束分離為CARS泵浦光束(780-880 nm)和CARS斯托克斯光束(900-1,320 nm)。斯托克斯光束進入商用脈沖整形器中,不僅用于CARS成像,還用于2PAF,SHG,3PAF和THG成像。然后,兩路光束通過另一個二向色鏡合束,并通過消色差物鏡(NA = 1．20)聚焦,消色差物鏡能夠實現衍射極限成像。

其中,脈沖整形器可以用于對脈沖振幅整形,進行頻譜選擇,讓不同波長的光通過,激發不同的非線性成像。還可以進行相位整形,用來補償相位,獲得變換極限脈沖,來激發SHG/THG/3PEF/2PEF;另外,斯托克斯脈沖通過脈沖整形器還能引入啁啾,通過電動裝置調節啁啾后的斯托克斯脈沖與泵浦脈沖之間的光學延遲,實現“光譜聚焦”,這種“光譜聚焦”的方式可以提高飛秒CARS的光譜分辨率,最后得到的該系統的光譜分辨率為14 cm-1。

并且使用者能對整形器的振幅-相位掩模進行預編程,這樣激光脈沖通過脈沖整形器后就會發生不同的改變,對應不同的非線性成像過程也就是激發不同的內源性物質。換一種說法就是激光在進行激發時作為可編程的變量,用脈沖整形器實現對激光的預編程,編程好的不同激光可用來激發不同的內源性物質(表1)。通過編程進一步將脈沖整形器變化脈沖與切換檢測通道相匹配,就能做到激發和檢測的匹配。

這樣,未經過激光和顯微鏡培訓的操作員在使用該成像系統時,能夠有選擇地在計算機屏幕上查看特定的內源性物質,通過按下預編程的按鈕可以立即(可以遠程進行)將當前成像物質更改為其他物質,激發和檢測過程無需進行組織染色和激光的重新對準。

圖2 無標記的多模態非線性成像系統

表1 預編程的激發/檢測參

該組使用該系統對大鼠的乳腺腫瘤進行了成像,在不同的非線性圖像及它們的復合圖像中(圖3、圖4)觀察到了正常細胞和腫瘤細胞的區別以及乳腺腫瘤生成的多個特征,與傳統組織病理學作比較,發現大部分特征在傳統組織病理學的圖像中都觀察不到,這也證明了無標記的多模態非線性成像系統的優勢。

圖3 乳腺標本的非線性多模態圖像及其相應的FFPE–H&E組織學圖像

圖4 乳腺標本的三模態圖像中顯示出的局部腫瘤浸潤的光學特征

總之,Haohua Tu等人提出的無標記的多模態非線性成像系統有多個優勢,他們將光子晶體光纖放到了激光器的后面,避免了激光源的光束漂移直接影響到顯微鏡成像;使用“光譜聚焦”的方式提高了飛秒CARS的光譜分辨率;用脈沖整形器實現對激光的預編程,編程好的不同激光用來激發不同的內源性物質,通過編程進一步將脈沖整形器變化脈沖與切換檢測通道相匹配,方便操作人員的使用。

審核編輯：符乾江