病原體循環(huán)標(biāo)志物的檢測對于疾病的診斷和治療監(jiān)控意義重大，但由于免疫復(fù)合物導(dǎo)致的屏蔽作用，以及不同病原體蛋白質(zhì)與抗體間的的交叉反應(yīng)，傳統(tǒng)免疫測定法的靈敏度和特異性較差。通過質(zhì)譜方法對標(biāo)志物蛋白中序列特異的多肽檢測可以很好的解決上述問題，甚至是對由于微小序列突變蛋白，或者是不同亞型細(xì)菌/病毒引發(fā)的疾病進(jìn)行分型。然而，質(zhì)譜檢測需要相對昂貴的設(shè)備和熟練的技術(shù)人員，因此不利于在傳染病經(jīng)常流行的、但資源有限的發(fā)展中地區(qū)廣泛推廣。

為了解決這些問題，來自杜蘭大學(xué)的胡曄教授課題組致力于尋求使用納米孔作為質(zhì)譜的經(jīng)濟(jì)替代技術(shù)的可能性，并將該技術(shù)用于臨床樣本中多肽生物標(biāo)志物的精準(zhǔn)識別和檢測。基于納米孔的傳感器可以在特定的施加電壓、pH和鹽濃度產(chǎn)生特征離子電流，并且該信號會在特定分子的相互作用產(chǎn)生非常敏感和特異的信號變化，從而形成對應(yīng)于特定靶標(biāo)特異的特征譜。這種原理已經(jīng)在核酸檢測和測序中被廣泛應(yīng)用。最近的研究還表明，由肽-納米孔相互作用產(chǎn)生的特征信號實(shí)現(xiàn)多肽標(biāo)準(zhǔn)品的精準(zhǔn)鑒定。然而，由于臨床樣本成分的復(fù)雜性，基于納米孔的多肽傳感器在臨床實(shí)際應(yīng)用中的可行性仍有待探索。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，為了填補(bǔ)基礎(chǔ)研究和臨床納米孔應(yīng)用之間的這一空白，近期，胡曄團(tuán)隊在Nano Today上發(fā)表了文章“Nanopore-based disease diagnosis using pathogen-derived tryptic peptides from serum”，開發(fā)了一種方法實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中與疾病相關(guān)多肽的檢測。

研究人員首先運(yùn)用理化性質(zhì)分析預(yù)測出高度抗原性的多肽序列，這種序列的多肽不僅可以和疾病高度相關(guān)，還可以與納米孔相互作用產(chǎn)生特異性的信號。接著，研究人員進(jìn)一步篩選純化出對該多肽具有高度親和力的單克隆抗體。通過對血清樣本進(jìn)行簡單的胰蛋白酶消化處理，該抗體便可以通過免疫沉淀的過程在血清樣本中高效的富集、純化和回收靶標(biāo)多肽。隨后，研究人員利用定制的算法對靶標(biāo)多肽與納米孔相互作用產(chǎn)生的電信號進(jìn)行鑒定和統(tǒng)計學(xué)分析，并且確定了具有特定的峰值電流和滯留時間的高度獨(dú)特的特征信號譜，實(shí)現(xiàn)了在寬的線性范圍內(nèi)對靶標(biāo)多肽的檢測。

多肽分析結(jié)合免疫純化技術(shù)實(shí)現(xiàn)納米孔在臨床疾病診斷中的應(yīng)用

此外，研究人員還進(jìn)一步研究了幾種可能影響納米孔傳感器開發(fā)的主要臨床干擾物，并優(yōu)化了樣品制備步驟以去這些干擾物對于測量的影響。以結(jié)核病為例，研究人員證明該方法可以將來自肺結(jié)核病人的血清，與來自非疾病對照的血清，以及在長時間抗結(jié)核治療后的病例區(qū)分開來。

該方法僅需要膜片鉗記錄裝置（用于納米孔的設(shè)備），以及用于血液樣本采集和臨床分離的常規(guī)臨床實(shí)驗室設(shè)備。然而，該方法的樣品前處理仍然需要一些人工操作，從而離實(shí)現(xiàn)高通量還有一定距離。該研究團(tuán)隊目前正在開發(fā)樣品制備和前處理的自動化裝置，以便于進(jìn)行大型臨床應(yīng)用驗證，并致力于進(jìn)一步開發(fā)小型化便攜式納米孔傳感器。

總體而言，該種檢測方法具有很好的普適性，可以很容易的應(yīng)用于生物標(biāo)志物的檢測，從而實(shí)現(xiàn)傳染病和慢性疾病的診斷和治療監(jiān)控。

論文鏈接： https://doi.org/10.1016/j.nantod.2022.101515

審核編輯 ：李倩