一個受精卵發(fā)育為一個復雜個體，正常體細胞變成腫瘤細胞，細胞作為生命的基本單位，其狀態(tài)的動態(tài)變化既是健康發(fā)育的基礎(chǔ)也是疾病產(chǎn)生的原因。從光學顯微鏡對細胞形態(tài)變化的觀察，到綠色熒光蛋白對細胞基因、表達定位等變化的追蹤，再到分子記錄器在基因組中穩(wěn)定寫入曾經(jīng)發(fā)生的分子事件，以及單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的發(fā)展，允許細胞全轉(zhuǎn)錄組的變化擬時序推測，每一次細胞動態(tài)變化記錄的技術(shù)變革均推動了細胞生物學的發(fā)展。既有方法或受限于對細胞形態(tài)或少數(shù)基因的動態(tài)表征，或依賴于擬時序分析中多種在實際細胞體系中可能無法滿足的假設(shè)，目前尚不能直接測量細胞全轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)變化。

8月17日，中國科學院深圳先進技術(shù)研究院、瑞士洛桑聯(lián)邦理工學院Bart Deplancke課題組、蘇黎世聯(lián)邦理工學院Julia Vorholt課題組合作，在《自然》（Nature）上以article長文形式，發(fā)表了題為Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells的研究論文。

該研究開發(fā)了活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（Live-seq），首次實現(xiàn)了單細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序后依然能夠保持細胞存活。該技術(shù)兼具全基因表達分辨率和動態(tài)解析能力，是當前對單細胞轉(zhuǎn)錄組直接動態(tài)測量、偶聯(lián)細胞現(xiàn)有狀態(tài)及其后續(xù)表型的唯一解決方案。

基因表達程序的變化是細胞對外源和內(nèi)源刺激反應(yīng)的重要表現(xiàn)。對單個細胞的連續(xù)觀測是細胞對刺激反應(yīng)、變化的重要研究手段，活細胞成像是最早的方法之一。隨著顯微成像技術(shù)和熒光標記手段的發(fā)展，顯微成像可實現(xiàn)從體外細胞培養(yǎng)到體內(nèi)環(huán)境下對基因表達的動態(tài)觀測。基因編輯技術(shù)的發(fā)展促進分子記錄器的出現(xiàn)。該技術(shù)通過細胞原生的或人工合成的基因線路，對刺激的感應(yīng)并將信息寫入基因組，記錄歷史分子事件。技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用促進細胞生物學的發(fā)展，例如活細胞成像已成為現(xiàn)代細胞生物學實驗室的常用手段；分子記錄器雖出現(xiàn)不久，但在體內(nèi)多場景的適用性和穩(wěn)定性上頗具潛力。而它們在記錄基因表達上存在共同的限制——在一個細胞中只能同時記錄一個或幾個基因的表達。

2009年湯富酬首創(chuàng)單細胞mRNA測序以來，不再只依靠少數(shù)幾個基因的表達來分析細胞類型，而可用整個轉(zhuǎn)錄組的狀態(tài)來更系統(tǒng)全面的定義細胞類型和狀態(tài)。單細胞轉(zhuǎn)錄組變革了對細胞狀態(tài)異質(zhì)性的解析能力，推動了發(fā)育生物學、腫瘤細胞學、免疫學和干細胞生物學等的發(fā)展。然而，研究只可測量細胞的靜態(tài)狀態(tài)，無法像前述的活細胞成像那樣連續(xù)觀測細胞的動態(tài)或檢查細胞后續(xù)的表型。為了克服這一限制，多種基于計算或標記的方法被開發(fā)出來。這些方法基于共同的假設(shè)，即群體的靜態(tài)分布可以模擬個體的動態(tài)運動。運用不同的數(shù)學模型和/或新舊RNA的標記等手段，研究將轉(zhuǎn)錄組相似的細胞連接，產(chǎn)生一條軌跡來代表一個細胞的變化路徑。這些方法提供了有意義的生物學認知，但由于這些前提假設(shè)在復雜細胞系統(tǒng)不一定能被滿足，其提供的變化路徑應(yīng)被解讀為一種統(tǒng)計學上的預期，而非細胞真正變化的軌跡。而這些限制的根本原因在于單細胞測序時裂解殺死了細胞，因而無法連續(xù)測量。

本研究中，科研人員開發(fā)出活細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（Live-seq），在進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序后，依舊保持細胞的存活和功能。該技術(shù)的核心是對部分細胞質(zhì)進行微創(chuàng)地提取，并對微量的細胞質(zhì)RNA進行擴增。具體地，該技術(shù)整合改造了多種跨學科技術(shù)（圖1）：具備納米級移動分辨率和皮牛頓力學靈敏度的原子力顯微鏡，實現(xiàn)超精密顯微操作；亞皮升級別的微/納流控通道和液壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)，實現(xiàn)微量（約1皮升）樣品提取和轉(zhuǎn)移；納米級的、中空可定量的、可和細胞膜無縫密封的特殊探針，可實現(xiàn)微創(chuàng)的細胞質(zhì)提取；相偶聯(lián)的實時跟蹤成像和細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可以長時間鎖定同一個細胞；高靈敏度的RNA擴增測序；對前述步驟的無縫整合。

圖1 Live-seq基本原理

Live-seq只對少量的細胞質(zhì)進行測序，其結(jié)果能否代表細胞的狀態(tài)？研究對多種類型和狀態(tài)的細胞進行活細胞測序，并平行地和單細胞測序結(jié)果進行比較。結(jié)果顯示活細胞測序結(jié)果和單細胞測序結(jié)果高度吻合，證明了Live-seq能夠較好的體現(xiàn)細胞的全轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)。這一過程是否改變細胞狀態(tài)甚至殺死細胞？研究對包括干細胞在內(nèi)的多種細胞類型進行評估，發(fā)現(xiàn)大部分細胞在Live-seq后仍然存活。同時，細胞分裂依然能夠正常進行（圖2）。研究通過對巨噬細胞對細菌脂多糖LPS刺激的反應(yīng)和脂肪干細胞分化過程的觀測發(fā)現(xiàn)，細胞的反應(yīng)未因Live-seq而有明顯變化。研究對接受和未接受細胞質(zhì)提取的細胞全轉(zhuǎn)錄組進行比較，也未發(fā)現(xiàn)大量的基因表達變化。結(jié)果顯示，Live-seq未對細胞的活性和功能產(chǎn)生較大影響。

圖2 Live-seq對細胞的影響，黃色的細胞被提取出細胞質(zhì)，藍色和紫色的細胞未被處理

由于細胞測試后仍舊存活，Live-seq首次實現(xiàn)對同一個細胞全基因表達的連續(xù)測量。作為概念驗證，Live-seq直接測定了同一個巨噬細胞和脂肪干細胞在刺激前后的變化路徑（圖3）。Live-seq可以回答細胞怎樣的過去決定它的現(xiàn)在。即使是單克隆來源的巨噬細胞對細菌脂多糖的反應(yīng)依舊有很大的異質(zhì)性。利用這一模型，研究表明起始狀態(tài)的少數(shù)基因的表達差異和噪音（如Nfkbia、Gsn等）是決定細胞后續(xù)反應(yīng)差異的重要原因，處于細S期的細胞對刺激反應(yīng)也更弱。對應(yīng)地，普通的單細胞轉(zhuǎn)錄組無法找到這些規(guī)律。

圖3 活細胞測序新可能：（左圖）對同一個細胞轉(zhuǎn)錄組的連續(xù)分析；（右圖）偶聯(lián)細胞起始的轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)（因）和后續(xù)細胞對刺激的反應(yīng)（果）

Live-seq仍有不足：與高通量的單細胞轉(zhuǎn)錄組相比，Live-seq是低通量的手段；Live-seq尚不能在體內(nèi)應(yīng)用；在高度極化而mRNA分布不均的細胞（如神經(jīng)細胞）中，Live-seq或無法體現(xiàn)全細胞轉(zhuǎn)錄組；多次采樣對細胞的干擾需要更多研究。未來持續(xù)的發(fā)展如自動化提高通量、通過和雙光子顯微鏡聯(lián)用運用于體內(nèi)樣品等，有望使上述不足得到改善。Live-seq第一次使得對活細胞的連續(xù)觀測成為可能，希望可以催生更多新可能。

研究工作得到國家重點研發(fā)計劃、深圳合成生物創(chuàng)新研究院的支持。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41586-022-05046-9

審核編輯 ：李倩