濱松光子學株式會社的科學家們根據(jù)彎曲樣品的表面形狀，使用濱松LCOS-SLM進行激發(fā)光波前調制，從而使雙光子激發(fā)顯微鏡(TPM)(物鏡為干鏡)可以進行高質量的深度觀察。當空氣和樣品之間的折射率界面是垂直于光軸的平面時，通常會發(fā)生嚴重的球差。彎曲的樣品表面形狀和折射率不匹配會引起包括球差在內的各種像差。因此，所獲得的圖像的熒光強度和分辨率在樣品的一定深度處變得很差。為了解決這個問題，濱松中央研究所及濱松大學的科學家Naoya Matsumoto, Alu Konno, Takashi Inoue 及 Shigetoshi Okazaki等人設計了一種預畸變波前，以通過使用全新的光程差算法來校正由彎曲的樣品表面形狀引起的像差。在通過折射率不匹配的界面之前，TPM系統(tǒng)中包含的空間光調制器將激發(fā)光波前調制為預畸變波前。因此，激發(fā)光經(jīng)過樣品后聚焦時就沒有像差。由此，通過使用干物鏡在清潔的小鼠腦中觀察到高達2,000μm的光學深度的血管。

近年來，隨著生物技術和醫(yī)學領域研究的發(fā)展，人類社會也一直在推進生物機能和疾病發(fā)病機理的研究。但是由于以往的觀察手段具有一定的局限性，對未作處理的動物內臟更深部結構的3D觀察需求日益增長。

雙光子激發(fā)顯微成像是一種通過用超短脈沖激光激發(fā)(照射)熒光物質來觀察激發(fā)的熒光的技術。 普通的光，通過散射和吸收是無法達到樣本深部的，而激發(fā)光可以，故激發(fā)光是3D觀察的有效手段。但是，對于實際生物體來說，因組織本身發(fā)生的像差而導致無法觀察深處部位。雖然如前面介紹的自適應光學器件可以消除相差，但這與眼底成像不同，因為各種各樣的原因不適用顯微鏡觀察，只能在限定的條件下使用。

濱松公司搭建了搭載SLM的雙光子激發(fā)顯微鏡，在此基礎上研究像差補償?shù)姆椒āＪ紫龋覀冃枰赖氖遣ㄇ盎?像差)。 由于這樣的系統(tǒng)很難應用自適應光學，因此無法使用波前傳感器進行測量。另外，與在激光加工中待加工的樣品不同，作為在顯微成像中待觀察的生物活體不僅形狀不確定，其內部也有復雜的折射率分布，從而不能計算像差(圖1左)。因此，我們假設活體內的折射率是一定的，將復雜的表面作形狀近似的簡單處理，在相似的條件下，通過較少的參數(shù)(平均折射率、形狀的相似系數(shù)等)設計了全新的像差計算方法。

圖1 在顯微鏡下觀察的生物樣品(左)和近似模型(右)的波前畸變(像差)

圖2顯示的是采用我們像差計算方法來觀察生物樣品的結果。樣品是采用市面上銷售的液體透明化處理的小鼠大腦(a)。在過去大約10年左右的時間里，透明技術得到了快速的發(fā)展。這也是3D觀察需求大幅增加的一個重要原因。

圖2鼠腦預掃描結果

·(a,b)熒光染料(Dil)染色的鼠腦照片。使用光學清潔介質(SeeDB)增強光學透過率。測量位置靠近(a)中藍色箭頭指示的位置。

·在不同的觀察區(qū)域時——淺表區(qū)域(c)與深層區(qū)域(d)——激發(fā)光穿過樣品表面的面積與樣品的尺寸間的關系。黃圈表示激發(fā)光穿過的面積，紅色虛線框表示預掃描的范圍。

·(e)為XY面的圖像，深度距離起始測量位置210μm。比例尺單位為200μm.

·(f)為計算所得樣品表面形狀。

圖3中間左列(a)，(b)和(c)是用新的像差校正方法獲得的三維成像圖片，讀取的不同深度的XY軸的成像圖像。與右列沒有進行像差補償?shù)?d)，(e)和(f)相比，它的分辨率、信噪比(SNR)要高。通過查看(g)，(h)和(i)中的圖形所示的每個圖像的輪廓也可以看出進行像差補償后的效果。如果不進行像差補償，圖像的對比度會隨著深度的增加而降低，在最深(1,798 μm)處結構就變得不清楚了。另一方面，如果做了像差補償?shù)脑挘词乖谏钐幍慕Y構也可以獲得很好的成像。

雖說雙光子激發(fā)顯微鏡適用于三維觀察，但是如結果所示，因為像差的影響，實際上普通的觀察是很難實現(xiàn)對深部成像的。 但是，通過使用我公司開發(fā)的SLM進行像差校正，可以觀察表面不平整的生物樣本的深處。 此外，因為同時照射多個點的高速成像和像差補償可以同時進行，在實際實驗中的高速成效效果是有目共睹的。

圖3鼠腦中血管的xy平面圖片。

(a,b) 400μm光學深度處使用SLM調制波前的圖像和未調制波前的圖像。 (c,d) 光學深度1116μm處的圖像。(e,f) 光學深度1798μm處的圖像。比例尺單位為50μm。虛線框為血管局部放大。通過SLM調制波前，大幅地提高了對比度和分辨率。

各種應用的開發(fā)

如此這般，通過采用SLM進行波前控制，通過多點同時照射，實現(xiàn)高速成像，再通過像差補償?shù)玫礁咂焚|成像，作為激光加工和成像的例子中已有所說明。多點同時照射也用于對相鄰多個點同時照射，以引起相互作用并進行特殊處理，對離開活體的細胞和組織同時進行光刺激。波前控制也為實現(xiàn)各種各樣的功能發(fā)揮作用，例如提高超出光學系統(tǒng)界限的分辨率(超分辨率)，生成從淺部到深部聚焦的特殊光束(非衍射光束)等。利用基于SLM的波前控制，除了可以輕松實現(xiàn)各種光學功能外，也可以實現(xiàn)動態(tài)切換、同時多種功能。利用此特點，除了用于激光加工和成像外，還適用于各種目的和領域的研究，例如光學操縱、量子光學和太赫茲波的產生等等。另外，雖然此次沒有介紹，我們也有各種對于超短脈沖光的時間波形控制的研究。

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圖4 實驗搭建

操縱模擬生物組織內的光傳輸路徑

所用SLM型號：-07無水冷型號

應用內容：生物組織具有各向異性的物理特性，入射到其中的光會發(fā)生漫射現(xiàn)象。這也是我們無法看到生物組織內部的主要原因。我們使用空間光調制器對入射光的波前進行整形，有效地補償了光在生物組織內部傳輸過程中所發(fā)生的波前畸變，從而實現(xiàn)對光傳輸路徑的操控。光經(jīng)生物組織實現(xiàn)聚焦是光路操縱的一種直觀形式，它對于激光掃描成像、激光靶向治療以及激光顯微操縱等應用都具有重要意義。

圖5兩幅分別為使用濱松空間光調制器調制前后的圖。左圖為高斯光打到樣品上(使用氧化鋅模擬生物樣品)，激光被樣品散射所得到的散斑;右圖為經(jīng)過客戶算法調制后的光斑，使用濱松空間光調制器調制，調制后可見一個聚焦很好的點，為算法重構的點。

圖5 實驗效果

審核編輯黃宇