乳腺癌（BC）是女性最常見的惡性腫瘤。在BC的四種亞型中，三陰性乳腺癌（TNBC）因其侵襲性強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)、易耐藥等特點(diǎn)，生存率明顯低于非轉(zhuǎn)移性亞型。同時(shí)，TNBC缺乏廣譜的標(biāo)記受體。因此，尋找合適的生物標(biāo)志物進(jìn)行早期診斷和不同亞型的檢測(cè)對(duì)癌癥治療至關(guān)重要。

近期，吉林大學(xué)超分子結(jié)構(gòu)與材料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室徐抒平課題組報(bào)道了機(jī)器學(xué)習(xí)輔助表面增強(qiáng)拉曼光譜學(xué)（SERS）用于基于微液滴的單細(xì)胞分析檢測(cè)，相關(guān)成果以“Single-Cell Analysis and Classification according to Multiplexed Proteins via Microdroplet-Based Self-Driven Magnetic Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Platforms Assisted with Machine Learning Algorithms”為題發(fā)表在國(guó)際化學(xué)權(quán)威雜志Analytical Chemistry上。

該研究構(gòu)建了一種基于微液滴-表面增強(qiáng)拉曼光譜（microdroplet-SERS）的單細(xì)胞檢測(cè)平臺(tái)，并開發(fā)了單細(xì)胞異質(zhì)性分析和不同BC亞型分類的工作流程。單細(xì)胞與捕獲探針（免疫磁珠，iMBs）和報(bào)告探針（immuno-SERS標(biāo)簽，iSERS tags）一起被包裹在微液滴中。在微液滴中，觀察到iMBs的一種獨(dú)特的界面定向聚集（IOA）效應(yīng)，即帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜傾向于吸引電中性捕獲探針（iMBs）自發(fā)地向細(xì)胞膜表面聚集。進(jìn)而外泌體蛋白和iSERS tags會(huì)被生物偶聯(lián)在iMBs上，形成三明治夾心結(jié)構(gòu)，通過對(duì)iSERS標(biāo)簽的SERS信號(hào)采集實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體蛋白的分析。實(shí)驗(yàn)中分析了3種外泌蛋白（FAK、CD9、CD63），因而制備了3種報(bào)告分子標(biāo)記的iSERS tags。iSERS tags在iMBs上的富集產(chǎn)生的熱點(diǎn)效應(yīng)對(duì)SERS信號(hào)的放大極為有利。

圖1 基于微滴的自驅(qū)動(dòng)磁SERS平臺(tái)輔助機(jī)器學(xué)習(xí)算法工具的基于多重外泌體蛋白的單細(xì)胞分析和分類的原理圖

實(shí)驗(yàn)中對(duì)iMBs聚集到細(xì)胞膜表面的動(dòng)態(tài)過程進(jìn)行監(jiān)控。可觀察到5分鐘之內(nèi)iMBs可以聚集在細(xì)胞膜表面。對(duì)25個(gè)液滴內(nèi)的細(xì)胞表面的iMBs數(shù)量統(tǒng)計(jì)顯示出較好的一致性。進(jìn)一步地，液滴內(nèi)的細(xì)胞在裂解液的作用下釋放游離的外泌體蛋白并被iMBs捕獲，并與iSERS tags形成免疫三明治結(jié)構(gòu)，進(jìn)而進(jìn)行SERS檢測(cè)。圖2C為三次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞外泌體蛋白的檢測(cè)結(jié)果。

圖2 （A）動(dòng)態(tài)監(jiān)控磁珠聚集過程；（B）不同單細(xì)胞表面磁珠的數(shù)量；（C）三次平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

對(duì)獲取到的兩種細(xì)胞系的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和聚類處理，分組聚類熱圖和降維算法可以很好的區(qū)分兩種細(xì)胞系。聚類分析顯示出4種亞群，這與蛋白的表達(dá)特征有關(guān)。

圖3 （A）兩種細(xì)胞系三種蛋白水平的分組聚類熱圖；（B）聚類分析；（C）t-分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE）降維散點(diǎn)圖；（D-F）三種蛋白的水平分布

利用隨機(jī)森林分類模型可區(qū)分兩種BC細(xì)胞系，其中訓(xùn)練集和測(cè)試集都顯示了良好的準(zhǔn)確率。采用受試者工作特征曲線（ROC）評(píng)價(jià)分類器的準(zhǔn)確率，曲線下面積（AUC）值為0.938，接近于1，表明該分類器性能良好。

圖4 隨機(jī)森林分類模型以及對(duì)模型的評(píng)估：（A）隨機(jī)森林錯(cuò)誤率矩陣；（B）用訓(xùn)練集測(cè)試分類器；（C）分類器用測(cè)試集進(jìn)行測(cè)試，單位為%；（D）分類器的二分類ROC曲線；（E）利用MDA和MDG指數(shù)對(duì)三個(gè)變量的重要性排序

綜上所述，該研究建立了一種基于微液滴的表面增強(qiáng)拉曼光譜方法，用于單細(xì)胞水平分析外泌體蛋白。該方法的關(guān)鍵是界面定向聚集效應(yīng)，可以通過聚集被探測(cè)細(xì)胞膜表面的捕獲探針來(lái)收集目標(biāo)蛋白和報(bào)告探針，使分散的蛋白富集到檢測(cè)點(diǎn)，同時(shí)通過形成熱點(diǎn)來(lái)放大信號(hào)，以提高液滴內(nèi)檢測(cè)靈敏度。基于該平臺(tái)的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到單個(gè)細(xì)胞的外泌體蛋白檢測(cè)的要求。此外，該研究引入了機(jī)器學(xué)習(xí)算法，用于發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中不同亞群的存在，并分析不同蛋白質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)。基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)集，該研究發(fā)現(xiàn)了不同亞群的不同性能特征，證實(shí)了單細(xì)胞存在明顯的異質(zhì)。





審核編輯：劉清