隨著全球傳染病的流行，核酸檢測(cè)技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和等溫?cái)U(kuò)增在各種疾病的快速診斷中發(fā)揮了重要作用。

通常情況下，樣品需要通過冷鏈運(yùn)輸?shù)脚鋫淞己玫尼t(yī)院或檢測(cè)中心進(jìn)行檢測(cè)。傳統(tǒng)的檢測(cè)過程高度依賴專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行人工操作，從樣品到結(jié)果的整個(gè)過程耗時(shí)較長(zhǎng)，無法滿足快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求，特別是在資源有限的地區(qū)。此外，樣品的運(yùn)輸不僅增加了成本，在儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件不當(dāng)?shù)那闆r下還可能導(dǎo)致樣本失效，造成假陰性結(jié)果。因此，開發(fā)快速、簡(jiǎn)單、低成本的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)平臺(tái)具有重要意義。

近日，北京師范大學(xué)-香港浸會(huì)大學(xué)聯(lián)合國(guó)際學(xué)院（UIC）雷波教授團(tuán)隊(duì)、暨南大學(xué)董鋮副教授與珠海市迪奇孚瑞生物科技有限公司合作開發(fā)了一種基于數(shù)字微流控（DMF）技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）顯色反應(yīng)的可視化檢測(cè)平臺(tái)。

該平臺(tái)包含多個(gè)反應(yīng)單元，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本中的多個(gè)靶標(biāo)基因，大大提高了檢測(cè)效率。此外，利用DMF強(qiáng)大的液滴操控能力，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化終點(diǎn)檢測(cè)，避免了傳統(tǒng)終點(diǎn)檢測(cè)方法中由于開蓋等人工操作引起的污染問題。該研究通過將高濃度的干燥染料應(yīng)用于LAMP的顯色檢測(cè)，大大提高了小體積反應(yīng)液滴（5 μl）的顯色程度，使得反應(yīng)結(jié)果無需特定的光源條件，在環(huán)境光照下即可進(jìn)行肉眼判讀。

圖1 用DMF-LAMP方法進(jìn)行對(duì)蝦疾病診斷：（a）樣品制備；（b）芯片上操作和LAMP反應(yīng)；（c）DMF芯片的側(cè)視圖和控制系統(tǒng)的方塊圖；（d）中性紅的分子結(jié)構(gòu)以及由陽(yáng)性LAMP擴(kuò)增引起的顏色轉(zhuǎn)變；（e）從樣品到結(jié)果的整個(gè)過程的時(shí)間軸

該平臺(tái)可以應(yīng)用于水產(chǎn)病害檢測(cè)，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出對(duì)蝦的三種常見病原體：腸細(xì)胞隱孢子蟲（EHP）、傳染性皮下和造血組織壞死病毒（IHHNV）以及白斑綜合征病毒（WSSV），檢測(cè)限為101拷貝/μL DNA。在這項(xiàng)研究中，該團(tuán)隊(duì)還對(duì)DMF-LAMP方法進(jìn)行了特異性和真實(shí)樣品檢測(cè)能力的評(píng)估。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法在與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌以及早期死亡綜合征（EMS）和對(duì)蝦血細(xì)胞虹彩病毒（SHIV）等水及水產(chǎn)品中常見病原體的交叉反應(yīng)測(cè)試中均無非特異性擴(kuò)增，表現(xiàn)出良好的特異性。在真實(shí)樣本檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，分別用DMF-LAMP法和qPCR商業(yè)試劑盒對(duì)58個(gè)蝦樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，DMF-LAMP方法與商業(yè)化的qPCR方法檢測(cè)結(jié)果高度一致，Kappa值在0.91至1之間，證明了該方法在實(shí)際應(yīng)用中的可靠性和準(zhǔn)確性。

圖2 DMF 芯片設(shè)計(jì)與制造：ITO玻璃上涂有疏水表面作為頂板，覆有疏水涂層的PCB基板被用作底板。在芯片組裝之前，底板上裝載了LAMP試劑并進(jìn)行了風(fēng)干處理。這兩個(gè)板之間夾著一個(gè)0.6 mm的間隔層用于液滴傳輸和LAMP反應(yīng) 該團(tuán)隊(duì)還提出一種基于RGB的圖像處理方法，利用智能手機(jī)在不同室外光照下獲得結(jié)果圖像，并且通過RGB分析，提出了一種簡(jiǎn)單的判讀方法，未來有望創(chuàng)建自定義的手機(jī)App，以實(shí)現(xiàn)大批量結(jié)果的快速自動(dòng)化分析。

圖3 基于RGB的圖像處理分析：（a）在DMF芯片上進(jìn)行包含中性紅的LAMP反應(yīng)，并使用智能手機(jī)捕捉圖像。手動(dòng)選擇感興趣區(qū)域（ROI），并在ImageJ中測(cè)量ROI的平均RGB值；（b）根據(jù)在實(shí)驗(yàn)室LED照明下捕捉的圖像提取RGB值，比較陰性反應(yīng)（n = 120）和陽(yáng)性反應(yīng)（n = 120）的平均值；（c）由陰性和陽(yáng)性反應(yīng)RGB值計(jì)算得出的差值；（d）在不同照明條件下，繪制陰性（N-）和陽(yáng)性（P-）結(jié)果的R/G比和B/G比的圖表

該成果以“A digital microfluidic platform coupled with colorimetric loop-mediated isothermal amplification for on-site visual diagnosis of multiple diseases”為題，發(fā)表在英國(guó)皇家化學(xué)會(huì)期刊Lab on a Chip上。

總體而言，該研究建立的DMF-LAMP平臺(tái)在臨床、生物醫(yī)學(xué)、食品安全和環(huán)境等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景，具有成本低、操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)效率高等優(yōu)勢(shì)。未來將進(jìn)一步在該平臺(tái)上整合樣本處理如核酸提取等步驟，以實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn)-結(jié)果出”的一體化檢測(cè)。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1039/D2LC01156E