眾所周知，入射角的正弦值與折射角的正弦值滿足如下關系：n1sin（i）=n2sin(r) ，假設n1=1.52（玻璃），n2=1（空氣），當折射角度等于90度時，對應的入射角度是臨界角：i=arcsin(1/1.52)，臨界角大概在41度左右。當入射角大于或等于臨界角的情況下，此時折射光線消失，即發(fā)生了全反射，

有人總結了全反射的九大應用：

1、光導纖維；2、全內反射熒光顯微鏡；3、全內反射是汽車雨量傳感器的工作原理，控制擋風玻璃雨刮器；4、光的空間濾波；5、雙筒望遠鏡中的棱鏡使用全內反射顯示直立圖像；6、一些多點觸摸屏幕使用全內反射拾取多個目標；7、前房角鏡檢查采用全內反射來觀察眼睛角膜和虹膜之間形成的解剖角度；8、步態(tài)分析儀器使用受抑全內反射分析嚙齒動物的足跡；9、光學指紋設備使用受抑全內反射記錄人的指紋圖像。

全內反射熒光顯微鏡（total internal reflection fluorescent microscope，TIRFM），利用光線全反射后在介質另一面產生衰逝波的特性，激發(fā)熒光分子以觀察熒光標定樣品的極薄區(qū)域，觀測的動態(tài)范圍通常在200nm以下。因為激發(fā)光呈指數(shù)衰減的特性，只有極靠近全反射面的樣本區(qū)域會產生熒光反射，大大降低了背景光噪聲干擾觀測標的，故此項技術廣泛應用于細胞表面物質的動態(tài)觀察。

TIRFM的實現(xiàn)是通過改變激光的入射角來實現(xiàn)的，按技術TIRF顯微鏡分為兩種：棱鏡型和物鏡型。棱鏡型TIRF顯微鏡采用棱鏡產生衰逝波，并用物鏡收集熒光成像。物鏡型TIRF顯微鏡采用大數(shù)值孔徑物鏡產生衰逝波，同時采用物鏡收集熒光成像。與棱鏡型TIRF顯微鏡相比，物鏡型TIRF的應用更為廣泛，它的基本結構見圖2：

圖2全內反射成像的基本原理（熒光沒有特意標出）

入射光線通過物鏡中心的一邊以大于全反射的角度匯聚到樣品一點，然后經(jīng)過物鏡的另外一側傳播（如果是熒光樣品，出射的光線波長不一樣）。通常要求從全內反射顯微物鏡出射的激發(fā)光能夠以觀察區(qū)域為中心繞系統(tǒng)光軸旋轉,從而實現(xiàn)全角度的全反射照明,常規(guī)的作法是使用一個二維振鏡組配合一個大口徑透鏡將入射激發(fā)光聚焦在全內反射顯微鏡物的后焦面上并使其繞光軸環(huán)狀掃描,進而達到全角度的全反射照明的目的。這個方案對于二維振鏡組的控制電路要求極高,不僅要求其具有很高的同頻和響應速度，因此,全內反射熒光顯微鏡中掃描模塊設計復雜，很難實現(xiàn)到實際儀器系統(tǒng)中。

解決的方案之一是使用環(huán)形錐透鏡實現(xiàn)環(huán)形照明，如圖3所示：

圖3 圓錐透鏡的工作原理

使用圓錐透鏡是可以產生環(huán)形照明，而且環(huán)的尺寸在不同位置尺寸可以改變。但是這種結構也是很難使用到TIR顯微鏡系統(tǒng)，因為很難得到平行光的環(huán)形照明，其次當改變環(huán)形的尺寸的時候，位置要發(fā)生變化，即系統(tǒng)的參數(shù)發(fā)生變化，很難實際使用。因此國內外的科學工作者做了很多努力解決這個問題（如使用SLM或者DMD）。例如，浙江大學劉旭團隊授權的發(fā)明專利“基于數(shù)字微鏡元件的全反射顯微鏡環(huán)形掃描方法和裝置”，如圖4所示：

圖4基于數(shù)字微鏡元件的全反射顯微鏡環(huán)形掃描方法和裝置

使用數(shù)字微鏡是一個不錯的實現(xiàn)環(huán)形照明的方案，但也是有一定的局限性，DMD的價格昂貴到不是主要問題，主要是由于衍射和光源能量損失比較大。西安交通大學雷銘教授在德國工作期間，2010年與Andreas Zumbusch在Optical Letters發(fā)表了采用W-錐鏡實現(xiàn)了環(huán)形照明，圖5：

圖5使用W-錐鏡的全反射環(huán)形照明

W-錐鏡的全反射環(huán)形照明是非常聰明的一個方案，重要的是在平行光路中工作，非常容易改變環(huán)形照明的尺寸。視頻1可以看到改變環(huán)尺寸的過程：

視頻1 W-錐鏡的工作示意圖

這個技術是來源于1986年美國的一項專利技術，如圖6所示：

圖6W-錐鏡的環(huán)形照明的專利信息

雷銘教授在圖5發(fā)表的文章中，非常尊重歷史的引述了專利信息作為參考文獻，8. G. T. Sincerbox, H. W. Werlich, and B. H. Yung, “Brightfield/darkfield microscope illuminator,” U.S. patent 4,585,315(April 29, 1986)。

這里還有一個小小的插曲，雷銘教授曾經(jīng)談起他使用W-錐鏡的經(jīng)歷，在沒有讀到美國這個專利的情況下，一天和同事討論出W-錐鏡的方案，兩個人非常的高興準備申請專利，沒有想到檢索發(fā)現(xiàn)Sincebox已經(jīng)在86年申請了專利。

W-錐鏡的方案在1986年就提出來了，沒有引起多數(shù)科學工作者的注意和使用，原因是作為非球面的內、外錐加工精度要求還是比較高，2012年筆者也是試圖使用這個環(huán)形照明方案用在SPR顯微鏡中，遺憾的是很難找到合適的加工商沒有實現(xiàn)。

隨著光學加工的水平不斷的提高，平行光的環(huán)形照明使用在TIRF和SPR顯微鏡中終會實現(xiàn)。

PS：

SPR和TIR成像系統(tǒng)結構非常的類似，也是有環(huán)形照明的需求。一般情況下SPR共振角度比全反射角度要大一些。因此在推送內容的主體部分沒有特意提及SPR成像系統(tǒng)。另外文中關于TIR和TIRF也是沒有特意的區(qū)分，因為系統(tǒng)結構基本一樣，主要區(qū)別是熒光系統(tǒng)需要使用二相色鏡、激發(fā)和發(fā)射濾光片而已。這里作為附錄簡單介紹一下SPRI：亞利桑那州立大學的研究人員首次利用表面等離子共振（SPR）效應開發(fā)了一款等離子激元散射顯微鏡（PSM），并成功實現(xiàn)了對單個分子（本研究中為蛋白質）的成像。目前，該工作于2020年9月21日以題目為“Plasmonic scattering imaging of single proteins and binding kinetics”發(fā)表在Nature Methods上。其中使用的儀器系統(tǒng)就是SPR顯微鏡，如圖8右所示：

圖7TIR和SPR成像系統(tǒng)的對比

從圖7的對比可以清楚看到兩種系統(tǒng)都是使用環(huán)形照明。






審核編輯：劉清