說(shuō)到組學(xué)研究，可能很多人都會(huì)想到基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組這些耳熟能詳?shù)拿帧５@些組學(xué)基本圍繞中心法則，從遺傳和基因表達(dá)的角度闡釋表型形成的分子機(jī)制。然而，隨著生物學(xué)研究的不斷深入，我們發(fā)現(xiàn)生命法則并不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性調(diào)控，而是復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中就包括各種類(lèi)型的化學(xué)修飾，修飾組學(xué)也逐漸被人所重視。越來(lái)越多的研究表明分子修飾可能導(dǎo)致信號(hào)通路和基因表達(dá)的變化，從而影響表型的形成。因此，為了讓大家能掌握修飾組學(xué)的研究思路，小編帶來(lái)了一篇上海交通大學(xué)薛紅衛(wèi)教授團(tuán)隊(duì)的文章，以磷酸化蛋白質(zhì)組為例，解讀修飾組學(xué)的研究策略。

01研究背景 蛋白質(zhì)磷酸化是由蛋白激酶進(jìn)行的主要翻譯后修飾，構(gòu)成真核生物中復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的組成部分。CK1（酪蛋白激酶1）在真核生物中高度保守，參與到植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的多種信號(hào)通路，發(fā)揮至關(guān)重要的作用。然而，對(duì)于CK1的內(nèi)源性底物研究的特性和廣度還未能全面探索。盡管一些公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)可用于預(yù)測(cè)底物和磷酸化殘基（磷酸化位點(diǎn)），但體內(nèi)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的結(jié)果十分困難，局限性大。因此，本研究借助LC+MS/MS DIA精準(zhǔn)定量磷酸化蛋白質(zhì)組的力量，探究AEL介導(dǎo)的磷酸化事件，鑒定新的磷酸化底物motif，并發(fā)現(xiàn)AEL（擬南芥的特異性CK1是AEL家族基因，包括AEL1/2/3/4）通過(guò)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組因子C3H17的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)胚胎發(fā)生，促進(jìn)該轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和反式激活活性。此外，研究者預(yù)測(cè)了水稻、小鼠和人中新的候選 CK1 底物，促進(jìn)研究 CK1 介導(dǎo)的磷酸化在不同物種中的作用。 02技術(shù)路線(xiàn)

為了方便各位老師快速掌握研究思路和結(jié)果，小編繪制了文章的研究框架圖，供各位觀賞。

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03研究結(jié)果

1. 篩選AEL調(diào)控的磷酸化肽段，并鑒定其motif特征

利用LC+MS/MS DIA，對(duì)擬南芥野生型、AEL過(guò)表達(dá)和功能缺失ael突變體進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組定量檢測(cè)及分析，獲得因AEL上調(diào)而上調(diào)的磷酸化肽段3985條，分布在1032個(gè)蛋白質(zhì)中。利用Motif-X分析這些上調(diào)磷酸化肽段，發(fā)現(xiàn)4個(gè)經(jīng)典CK1底物motif，并鑒定到4個(gè)新的motif。這些結(jié)果通過(guò)實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行驗(yàn)證。

Fig.1 AEL 磷酸化motif的鑒定和驗(yàn)證

2. 富集分析發(fā)現(xiàn)AEL的功能

為了研究AEL調(diào)控的生物學(xué)功能，對(duì)上述1032個(gè)蛋白質(zhì)和用8個(gè)motif在數(shù)據(jù)庫(kù)查找到的3509個(gè)預(yù)測(cè)的AEL底物蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)了AEL在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、環(huán)境脅迫、代謝、細(xì)胞分裂、激素響應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的功能。此外，富集分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了與開(kāi)花時(shí)間調(diào)控相關(guān)的類(lèi)別，表明AEL可能通過(guò)結(jié)合不同的翻譯后修飾來(lái)調(diào)控特定的發(fā)育階段。

Fig.2 利用鑒定到的motif預(yù)測(cè)AEL的底物并進(jìn)行功能分析

3. 從AEL的底物中挑選與胚胎發(fā)育相關(guān)的C3H17為了研究蛋白磷酸化對(duì)于擬南芥胚胎發(fā)育的影響，研究者從上調(diào)磷酸化蛋白質(zhì)中挑選了C3H17（一種 CCCH 型鋅指轉(zhuǎn)錄因子）繼續(xù)研究。該蛋白占據(jù)了生殖和胚胎發(fā)育相關(guān)的多個(gè)生物過(guò)程交匯處的核心位置，并且其功能缺失突變體表型與ael三重突變體相同，即胚胎發(fā)育異常和停滯。4. AEL介導(dǎo)C3H17磷酸化在胚胎發(fā)育中至關(guān)重要

選定要研究的底物蛋白質(zhì)后，研究者首先用體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了組學(xué)結(jié)果，確認(rèn)AEL可以與C3H17互作。然后，利用Scansite算法和LC-MS/MS技術(shù)鑒定出AEL使C3H17磷酸化的兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)：S492和T585，并在C3H17模擬非磷酸化突變體（C3H17AA）和ael突變體中進(jìn)行驗(yàn)證。

接下來(lái)，研究者想知道C3H17磷酸化后會(huì)發(fā)生怎樣的變化。因此，研究者在野生型、AEL突變體、C3H17模擬磷酸化（C3H17DE）和C3H17AA突變體中檢測(cè)了C3H17蛋白的降解程度，并發(fā)現(xiàn)AEL1-OE和C3H17DE突變體中降解程度低，說(shuō)明AEL介導(dǎo)的磷酸化抑制了降解，從而增強(qiáng)了C3H17的體內(nèi)穩(wěn)定性。此外，C3H17作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的三個(gè)下游基因CRU3、OLEO1和OLEO2在AEL-OE表達(dá)更高，c3h17突變體中表達(dá)較低；在C3H17AA突變體中基因轉(zhuǎn)錄受抑制，而在C3H17DE突變體中基因轉(zhuǎn)錄活性增加，證實(shí)了AEL通過(guò)磷酸化促進(jìn)了C3H17的轉(zhuǎn)錄激活活性。

最后，研究者想要探究AEL介導(dǎo)C3H17磷酸化后會(huì)對(duì)擬南芥的發(fā)育產(chǎn)生哪些影響。當(dāng)過(guò)表達(dá)C3H17，尤其是C3H17DE，能夠拯救ael123中觀察到的胚胎流產(chǎn)表型，而無(wú)論在野生型還是AEL突變體中，過(guò)表達(dá)C3H17AA加劇了胚胎流產(chǎn)，說(shuō)明AEL通過(guò)磷酸化C3H17在胚胎發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的差異基因和富集分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)果。此外，參與細(xì)胞分裂、胚胎發(fā)育等信號(hào)通路的三個(gè)基因IPT7、IMD1和NHL6在ael123、c3h17-1和模擬非磷酸化的ael123中的表達(dá)受抑制，但在表達(dá)C3H17DE的ael123中被誘導(dǎo)，表明這些基因可能在C3H17的下游發(fā)揮作用，其功能依賴(lài)于C3H17的磷酸化，可能在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

Fig.3 AEL介導(dǎo)C3H17磷酸化在胚胎發(fā)育中的關(guān)鍵作用

5. 預(yù)測(cè)CK1在植物和哺乳動(dòng)物中的底物并確認(rèn)其功能保守性

上述結(jié)果在擬南芥中確認(rèn)了CK1及其底物蛋白在胚胎發(fā)育中的重要作用。接下來(lái)，研究者打算在不同物種中分析CK1的保守性。從人、小鼠、水稻的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中利用鑒定出的8種motif序列進(jìn)行篩選，獲得了CK1大量的候選底物蛋白。通過(guò)GO和KEGG功能富集分析，發(fā)現(xiàn)CK1在單子葉和雙子葉植物中具有保守的功能。染色體和染色質(zhì)組織、細(xì)胞分裂過(guò)程中的關(guān)鍵事件的GO類(lèi)別在小鼠、人和擬南芥中富集程度高，表明細(xì)胞分裂是真核生物中由 CK1 調(diào)節(jié)的最重要、最保守的生物學(xué)機(jī)制。這些結(jié)果將有助于研究CK1在植物和哺乳動(dòng)物中的保守功能。

Fig.4 人CK1底物的分子功能

04主要結(jié)論

本研究利用LC+MS/MS DIA定量檢測(cè)擬南芥中的磷酸化蛋白質(zhì)組，識(shí)別CK1底物和顯著變化的磷酸化肽段，并利用Motif-X鑒定出8個(gè)CK1的底物motif，可用于預(yù)測(cè) CK1 的候選底物和功能。通過(guò)生化和遺傳分析對(duì)新鑒定的底物C3H17進(jìn)行了功能表征，揭示了 AEL 促進(jìn)的 C3H17 蛋白穩(wěn)定性和反式激活活性在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)生中的作用。由于 CK1 在真核生物中高度保守，研究者使用新鑒定的 CK1 底物motif搜索了水稻、小鼠和人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了比目前已知更多的候選底物，拓展了我們對(duì)CK1在植物和哺乳動(dòng)物中功能的理解，推動(dòng)CK1介導(dǎo)的磷酸化在不同物種中的機(jī)制研究。