砷污染是全球性的健康問題，全世界大約有1.4億人口的飲用水不能滿足WHO規(guī)定的飲用水安全限（10 ppb）。長期飲用砷含量超標的飲用水將引起一系列的健康問題，甚至癌癥病變。因此，美國的有毒物質(zhì)和疾病登記署（ATSDR）多年來一直將砷排在危險物質(zhì)名單的前列。為準確評估砷污染水平，使人類免受高砷環(huán)境的毒害，亟需開發(fā)高靈敏、快速，可靠的方法用于砷污染分析。

相比傳統(tǒng)的高端分析方法用于砷檢測，全細胞生物傳感器（Whole-CellBiosensor）由于具有低花費、便攜、環(huán)境友好等優(yōu)勢而受到青睞。然而基于天然砷調(diào)控系統(tǒng)（ArsR/Pars）的全細胞生物傳感器通常存在高泄露表達、低誘導倍數(shù)等問題，導致傳感器的背景噪音和信噪比不能滿足應用需求。這主要是由于ArsR轉(zhuǎn)錄因子不能嚴格控制Pars啟動子的轉(zhuǎn)錄。誘導-轉(zhuǎn)錄調(diào)控作為砷傳感系統(tǒng)的唯一控制器，選擇嚴謹調(diào)控的Pars啟動子對于開發(fā)高靈敏的全細胞砷傳感器至關(guān)重要。盡管之前的研究通過啟動子工程，信號放大和翻譯后調(diào)控等策略可以有效改善傳感器的信噪比。

然而，那均需要額外添加ArsR結(jié)合位點（ABS）來降低傳感器的泄露，其結(jié)果也表明ABS的添加不利于傳感器的信號輸出和靈敏度。因而需要對砷調(diào)控啟動子Pars進行從頭設(shè)計，然而，由于其ABS長達33 bp很難通過傳統(tǒng)的方法將其自由的嵌入啟動子不同位置。

近日，石河子大學葉邦策教授和浙江大學王寶俊教授作為共同通訊作者（石河子大學博士生陳升言為第一作者）在Analytical Chemistry雜志合作發(fā)表了題為“De Novo Design of the ArsR Regulated Pars Promoter Enables a Highly Sensitive Whole-Cell Biosensor for Arsenic Contamination”的文章。



圖1 高靈敏熒光傳感器的開發(fā)及比色傳感陣列的快速分析

該研究將來源于Escherichia coliMG1655的砷響應系統(tǒng)（ArsR/Pars）作為感應元件，并分別耦合gfp和lacZ為報告基因用于重構(gòu)啟動子的表征。為了能有效的降低傳感器的泄露表達并不損失傳感器的信號輸出和靈敏度，該研究將長達33bp的ABS序列與RNA聚合酶結(jié)合位點（即-10和-35位點）序列庫進行比對，挖掘了ABS序列內(nèi)潛在的RNA聚合酶結(jié)合位點。通過分析、設(shè)計和優(yōu)化，獲得了不同結(jié)構(gòu)的啟動子模型。并通過將ABS序列最大程度的嵌入啟動子核心區(qū)（即-10和-35位點之間，約17 bp），獲得了最大抑制效率和最高誘導倍數(shù)的新啟動子ParsOC2，實現(xiàn)了泄露表達和信號輸出的同時改善。基于該啟動子開發(fā)的熒光傳感器PlacV-ParsOC2在高于9.38 pp砷濃度時，展現(xiàn)出裸眼可見的綠色熒光；在300 ppb砷濃度時，誘導倍數(shù)提高至183.52倍；檢測限低至0.24 ppb，比WHO規(guī)定的飲用水安全水平10 ppb低了41.67倍。



圖2 不同砷響應啟動子構(gòu)成的熒光傳感器的表征

為了快速診斷砷濃度是否超過安全水平限值，該研究使用lacZ取代了gfp作為報告基因（其產(chǎn)物β-半乳糖苷酶能催化無色底物X-Gal顯藍色）以產(chǎn)生肉眼可區(qū)分的信號輸出。并驗證了重構(gòu)的啟動子ParsOC2相比野生型啟動子ParsOWT擁有更低的背景和更靈敏的顏色反應。最優(yōu)的比色傳感器PlacV-ParsOC2-lacZ在0-5 ppb范圍內(nèi)呈良好的線性，R2= 0.9928；檢測限低至0.39 ppb，比WHO規(guī)定的飲用水安全水平10 ppb低了25.64倍。

基于最優(yōu)的比色傳感器制備了比色傳感陣列，并將其耦合智能手機來實現(xiàn)便攜設(shè)備對地下水砷樣品的快速分析。通過智能手機拍照對不同稀釋因子下的地下水砷樣品的顏色反應結(jié)果進行快速記錄，并通過顏色識別軟件，對比色陣列中的每一個顏色結(jié)果進行分析，以實現(xiàn)對砷污染狀況的快速評估。最終，該傳感器的評估結(jié)果與樣品的實際濃度保持良好的一致性，回收率在86.08-94.26%之間。



圖3 比色法耦合智能手機分析用于砷的測定

綜上所述，為解決砷響應全細胞傳感器的高泄露和低誘導倍數(shù)等問題，針對帶有長足跡位點的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的啟動子，該研究提出了新的啟動子從頭設(shè)計方法。相比易錯PCR和高通量篩選等方法，該方法簡便有效；同時不需要額外的遺傳組分即可降低泄露和增加信號輸出，為其它啟動子的從頭設(shè)計和傳感器的開發(fā)提供了重要參考。該方法通過改變啟動子的結(jié)構(gòu)配置，從根本上提高了ArsR對Pars啟動子的阻遏效率，避免了通過使用過量的ArsR和額外添加ABS來降低傳感器的泄露。因此，該方法可以在有效降低泄露表達和增加誘導倍數(shù)的同時，而不影響傳感器的靈敏度和信號輸出。該研究通過耦合智能手機實現(xiàn)比色結(jié)果的快速分析，將促進全細胞傳感器的現(xiàn)場應用及砷污染的快速評估。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c00055

審核編輯：劉清