細胞的穩態離不開內部多種亞細胞結構的精確分工和協同合作，洞悉細胞內細胞器/蛋白分子的精密運轉是一項重要的生命科學研究需求，為揭示發育、疾病等浩瀚生命現象的微觀機制提供重要參考。借助熒光顯微成像技術，人們得以實現對亞細胞結構的特異性觀測，但因光學衍射極限的存在，成像的分辨率被限制在200納米左右，這大大阻礙了對其精細結構的進一步探究。超分辨熒光顯微成像技術的出現，使清晰觀測亞細胞結構成為可能，但目前主流的超分辨熒光顯微鏡需通過多組圖像測量來突破光學衍射極限，伴隨著顯著降低的時間分辨率和劇增的光毒性。對活細胞進行低侵入性、高時空分辨率的精細觀測目前依然存在巨大的挑戰。

針對上述問題，華中科技大學費鵬教授課題組聯合武漢光電國家研究中心張玉慧教授課題組于2022年3月12日在Nature Methods在線發表題為Isotropic super-resolution light-sheet microscopy of dynamic intracellular structures at subsecond timescales的研究論文。文章提出了一種基于深度學習的超分辨熒光顯微鏡，實現對活細胞的精細動態和相互作用進行快速、三維、長時程地觀測。

圖1 IDDR-SPIM成像技術的原理。a. 經典Lattice光片、Field synthesis光片和本文雙環光片產生原理和效果的對比；b. 分而治之-協同優化的漸進式深度學習超分辨重建算法

研究在硬件上提出一種基于雙環掩膜（Double-Ring, DR）調控的選擇性光片照明方法（DR-SPIM），利用多級調制光的衍射顯著抑制光片旁瓣的同時產生厚度僅為450納米的超薄、靜態、消色差光片，提供高軸向分辨率的原始三維圖像并大幅度降低成像對活細胞的光毒性（圖1a）。圖像處理上，針對原始圖像中噪聲，衍射極限等多因素耦合造成的復雜降質，研究者們進一步提出各向同性、分而治之（Isotropic Divide-stage-to-process, ID）的計算重建新思路，構建了多段級聯的卷積神經網絡，先利用局部多級先驗知識的分段訓練精確模擬成像物理過程，再通過多種損失函數的聯合優化對網絡進行整體約束，將光學成像中固有的噪聲、光學模糊、降采樣、非均一性等降質問題聯合求解，大幅度提升了算法在應對低信噪比-低分辨率圖像時的增強性和精確性。最終基于單組帶噪、衍射受限的光片圖像即實時重建出高信噪比的超分辨圖像。（圖1b）。

光學和算法的軟硬聯合（IDDR-SPIM），克服了超分辨成像中時間和空間分辨率的相互妥協，無損速度地打破衍射極限，將活細胞三維成像空間分辨率提升到各向同性100納米的同時實現視頻速度的高時間分辨率。

圖2 五維（時間+三維空間+光譜）活細胞超分辨成像揭示線粒體/內質網，線粒體/Drp1寡聚體的三維動態相互作用

研究人員進一步實現了GFP標記內質網和RFP標記線粒體結構的同步-三維-動態超分辨成像，捕捉到了內質網調控線粒體分裂的精細三維動態過程，并基于高時空分辨率的數據對內質網與線粒體的三維相互作用進行定量分析（圖2a, b）。而得益于IDDR-SPIM成像極低的光漂白率，研究人員還對Drp1寡聚體調控線粒體分裂或分支的過程進行了持續觀測，并分類表征了線粒體附著蛋白和游離蛋白在運動軌跡和速度上的不同（圖2c-e）。由于蛋白寡聚體較細胞器結構體積更小，包含熒光分子更少，且在三維空間均存在運動，使用傳統的超分辨顯微鏡均難以捕捉，更難以完成長時間觀察。

簡言之，該研究提出了一種新的光片超分辨顯微成像策略，通過多級衍射調控的光片照明成像技術聯合分而治之的深度學習單圖超分辨算法，大幅突破現有三維超分辨成像的時空分辨率極限，為快速、三維、長時程地觀測活細胞的精細動態和相互作用提供了強有力的新工具。

費鵬教授和張玉慧教授為本文共同通訊作者。費鵬課題組博士生趙宇軒、周瑤，張玉慧教授課題組博士后張朦、博士生張文婷為論文共同第一作者。本研究在基金委重大研究計劃培育項目、基金委面上項目、國家重點研發計劃、基金委重大儀器研制項目、武漢光電國家研究中心WNLO創新基金的資助下開展和完成。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41592-022-01395-5

審核編輯 ：李倩