微流體的運(yùn)輸、分配和混合通常需要借助額外的器件，如泵和閥門，不利于其在即時(shí)診斷（POC）裝置中的應(yīng)用。因此，美國加州大學(xué)Du Ke教授及其團(tuán)隊(duì)提出了一種簡單的微流控病原體檢測系統(tǒng)，稱為旋轉(zhuǎn)芯片，通過手動(dòng)旋轉(zhuǎn)兩個(gè)同心層在微孔之間轉(zhuǎn)移試劑，而不使用外部儀器。該旋轉(zhuǎn)芯片是由一個(gè)簡單的計(jì)算機(jī)數(shù)控（CNC）加工工藝制造的，并能夠通過一個(gè)簡單的30度或60度旋轉(zhuǎn)進(jìn)行60次多路反應(yīng)。利用超疏水涂層，在沒有明顯泄漏的情況下，流體輸送效率可以達(dá)到92.78%。與細(xì)胞內(nèi)熒光檢測相結(jié)合，對耐淀粉類大腸桿菌（E. coli）的芯片上檢測限為1.8×10?CFU/mL，這與該研究的芯片外檢測結(jié)果相似。此外，該研究還開發(fā)了一種計(jì)算機(jī)視覺方法來自動(dòng)識別芯片上的陽性和陰性樣本，顯示了100%的準(zhǔn)確性。

該旋轉(zhuǎn)芯片具有簡單、低成本和高通量的優(yōu)勢，并可以用單個(gè)芯片圖像顯示測試結(jié)果，是在資源有限的環(huán)境下進(jìn)行各種多路復(fù)用POC應(yīng)用的理想選擇。相關(guān)研究內(nèi)容以“Superhydrophobic Rotation-Chip for Computer-Vision Identification of Drug-Resistant Bacteria”為題發(fā)表在ACS AMI期刊上。

圖1a顯示了大腸桿菌檢測試驗(yàn)的結(jié)果，在透照器的紫外光下，在旋轉(zhuǎn)芯片中可以觀察到定性檢測結(jié)果。圖1b顯示了旋轉(zhuǎn)芯片作為一對數(shù)控加工的具有不同特征的聚碳酸酯圓盤的組裝。圖1c及其附屬橫截面圖顯示了在試驗(yàn)中運(yùn)行測試組的操作機(jī)制，其中藍(lán)色和紅色液體分別代表試劑和樣品。在圖1d中，兩步芯片執(zhí)行相同的流體動(dòng)力學(xué)，但加入二次試劑產(chǎn)生兩種試劑的混合物，在60度旋轉(zhuǎn)結(jié)束時(shí)混合樣品，分別用紅色、紫色和黃色表示。

圖1 旋轉(zhuǎn)芯片的設(shè)計(jì)和操作

圖2a分別為無涂層的旋轉(zhuǎn)芯片、特氟隆涂層和neverwet涂層的接觸角（從左到右），其中，NeverWet涂層處理的疏水性最強(qiáng)，其靜態(tài)接觸角為156.8°。旋轉(zhuǎn)芯片在NeverWet涂層前后的掃描電鏡圖像如圖2b所示，NeverWet涂層由氟碳涂層的二氧化硅顆粒組成，以產(chǎn)生表面粗糙度和天然的超疏水性。NeverWet涂層旋轉(zhuǎn)芯片在不同條件下的泄漏計(jì)數(shù)如圖2c所示。圖2d顯示了未涂層、聚四氟乙烯涂層和NeverWet涂層旋轉(zhuǎn)芯片的傳輸效率結(jié)果，NeverWet涂層芯片運(yùn)輸92.78%，而特氟隆涂層的試劑僅為86.02%。圖2e是在NeverWet涂層前后的兩步芯片上的食品染料演示，在NeverWet涂層（上排）之前，在試劑加載和芯片旋轉(zhuǎn)過程中都有液體泄漏，經(jīng)過NeverWet涂層（下排）后，液體泄漏顯著最小化，避免了樣品污染，提高了試劑利用率，提供了更準(zhǔn)確的結(jié)果讀數(shù)。

圖2 旋轉(zhuǎn)芯片的表面處理及傳輸效率

圖3a顯示了β-gal對非熒光FDG的兩步連續(xù)水解，首先將其轉(zhuǎn)化為單-半乳糖苷酶（FMG），然后轉(zhuǎn)化為高熒光熒光素（激發(fā)/發(fā)射，488/512），可以通過LED透照器檢測到。對純化的不同活性（0 - 1 U）的β-gal進(jìn)行反應(yīng)的芯片外檢測結(jié)果的熒光強(qiáng)度（512 nm）如圖3b所示。隨著β-gal濃度的增加，F(xiàn)DG水解產(chǎn)生更多的熒光素，熒光強(qiáng)度增加（圖3c）。在上片實(shí)驗(yàn)中，在試劑陣列中加入100μL FDG，每孔中依次加入5μLβ-gal。經(jīng)過旋轉(zhuǎn)和孵育后，用LED照明器從底部激發(fā)芯片，結(jié)果如圖3d所示。

圖3 β-半乳糖苷酶（β-gal）對熒光素二?-D-半乳糖糖苷（FDG）的影響

如圖4a所示，當(dāng)大腸桿菌濃度高于1.8×10?CFU/mL時(shí)，用肉眼可以很容易地觀察到陽性組和陰性組之間的熒光差異。然后用熒光光譜儀定量各組的熒光強(qiáng)度，在FDG濃度為0.25 nM時(shí)的結(jié)果如圖4b所示。當(dāng)FDG濃度為0.25 nM時(shí)，四組間的積分熒光信號最高，log-log線性擬合最佳（Pearson‘s r = 0.9734）（圖4c），因此選擇了0.25 nM的FDG進(jìn)行上片實(shí)驗(yàn)。孵育前的FDG和大腸桿菌負(fù)載芯片，大腸桿菌濃度在1.8×10?~9×10?CFU/mL之間（圖4d（上））。當(dāng)大腸桿菌濃度高于1.8 ×10?CFU/mL時(shí)，很容易觀察到熒光信號，與芯片外的結(jié)果相當(dāng)（圖4d（底部））。

圖4 通過改變FDG濃度優(yōu)化大腸桿菌

圖像處理和測試樣本分類的整個(gè)管道如圖5所示。將檢測到的陽性樣本與陰性樣本分離，最終獲得了100%的分類準(zhǔn)確率。

圖5 計(jì)算機(jī)視覺的圖像處理和測試結(jié)果

綜上所述，旋轉(zhuǎn)芯片與其他POC系統(tǒng)相比，由于其設(shè)計(jì)、操作和可制造性，在病原體檢測方面有許多優(yōu)勢。首先，旋轉(zhuǎn)芯片的設(shè)計(jì)具有良好的便攜性、高通量和可靠性。通過采用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)，旋轉(zhuǎn)芯片可以提供相同的流體操作，同時(shí)保持所有敏感特性在一個(gè)覆蓋狀態(tài)，并保持機(jī)械完整。這種設(shè)計(jì)降低了芯片的空間足跡，并增加了其最大特征密度，以提高可移植性和通量。疏水性表面處理是一種有效的防泄漏解決方案，而不影響機(jī)械完整性或需要專用密封，可以通過使用市面上廉價(jià)且易于應(yīng)用的的噴涂涂層來實(shí)現(xiàn)超疏水表面。其次，旋轉(zhuǎn)芯片的簡單設(shè)計(jì)只需要一個(gè)簡單的手動(dòng)操作，以及一個(gè)簡單的四步過程：加載、旋轉(zhuǎn)、孵育和讀取。用戶可以遵循上述流程，在無需使用復(fù)雜實(shí)驗(yàn)室設(shè)備或解釋熒光曲線的情況下獲得定性結(jié)果。這降低了過程的復(fù)雜性，并進(jìn)一步降低了成本，無需使用水浴及其附件供應(yīng)，如可密封袋，以防止水在孵化期間進(jìn)入芯片。在未來，智能手機(jī)應(yīng)用程序可以開發(fā)使用本研究中強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)視覺的方法，并直接與旋轉(zhuǎn)芯片結(jié)合，以精確、自動(dòng)和高通量的檢測應(yīng)用程序。

審核編輯：劉清