即使在基因相同的癌細(xì)胞中，對(duì)治療的抵抗也經(jīng)常出現(xiàn)在這些細(xì)胞的一小部分中。初始群體中稀有單個(gè)細(xì)胞的分子差異使某些細(xì)胞對(duì)治療產(chǎn)生耐藥性；然而，人們對(duì)耐藥結(jié)果的變異性知之甚少。在此研究中，研究者開(kāi)發(fā)并應(yīng)用 FateMap，這是一個(gè)將 DNA 條形碼與單細(xì)胞 RNA 測(cè)序相結(jié)合的框架，以揭示數(shù)十萬(wàn)接受抗癌治療的克隆的命運(yùn)。

研究者發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞來(lái)源的癌細(xì)胞中出現(xiàn)的耐藥克隆在分子、形態(tài)和功能上都具有不同的耐藥類(lèi)型。這些耐藥類(lèi)型很大程度上是由添加藥物之前細(xì)胞之間的分子差異決定的，而不是由外在因素決定的。藥物劑量和類(lèi)型的變化可以改變初始細(xì)胞的耐藥類(lèi)型，導(dǎo)致某些耐藥類(lèi)型的產(chǎn)生和消除。來(lái)自患者的樣本顯示了臨床背景下這些耐藥類(lèi)型存在的證據(jù)。他們觀(guān)察到幾種單細(xì)胞來(lái)源的癌細(xì)胞系和用多種藥物治療的細(xì)胞類(lèi)型的耐藥類(lèi)型的多樣性。由于內(nèi)在細(xì)胞狀態(tài)的可變性而導(dǎo)致的耐藥類(lèi)型的多樣性可能是對(duì)外部線(xiàn)索反應(yīng)的一般特征。

01 技術(shù)路線(xiàn)

02 研究結(jié)果

1、藥物治療后出現(xiàn)了不同的命運(yùn)

研究者重點(diǎn)關(guān)注 BRAFV600E 突變黑色素瘤，其中使用靶向療法維莫非尼治療單細(xì)胞衍生細(xì)胞可導(dǎo)致稀有（千分之一或更少）細(xì)胞存活，這些細(xì)胞會(huì)增殖形成耐藥集落。研究者對(duì)單個(gè)組織培養(yǎng)皿中所有抗性集落的混合物進(jìn)行了 scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)抗性類(lèi)型的基因表達(dá)譜表現(xiàn)出廣泛的多樣性。

為了同時(shí)確定每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜和克隆起源，研究者開(kāi)發(fā)了 FateMap，這是一種使用轉(zhuǎn)錄 DNA 條形碼同時(shí)識(shí)別來(lái)自數(shù)千個(gè)耐藥細(xì)胞的克隆的方法。首先，慢病毒條形碼整合到未經(jīng)治療的細(xì)胞的 DNA 中。憑借龐大的條形碼庫(kù)復(fù)雜性（大約 5900 萬(wàn)個(gè)獨(dú)特的條形碼）和較低的 MOI，可以對(duì)數(shù)千個(gè)細(xì)胞進(jìn)行獨(dú)特的條形碼標(biāo)記并通過(guò)分選進(jìn)行富集。研究者將帶有條形碼的細(xì)胞暴露于維莫非尼，收集耐藥群體，進(jìn)行scRNA-seq，并通過(guò)以鏈接克隆條形碼和細(xì)胞標(biāo)識(shí)符的方式選擇性擴(kuò)增和測(cè)序cDNA文庫(kù)，提取每個(gè)細(xì)胞的FateMap克隆條形碼。結(jié)果顯示抗性細(xì)胞存在明顯的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。

圖1 FateMap揭示了克隆間命運(yùn)類(lèi)型多樣性是由單個(gè)細(xì)胞在治療過(guò)程中產(chǎn)生的

2、耐藥類(lèi)型功能多樣

接下來(lái)研究者測(cè)試了轉(zhuǎn)錄上不同的抗性克隆是否具有不同的表型特性。研究者計(jì)算了不同耐藥類(lèi)型的每個(gè)克隆的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示不同的耐藥類(lèi)型具有不同的增殖能力。研究者也發(fā)現(xiàn)，不同的抗性克隆在膠原基質(zhì)中有明顯不同的侵襲區(qū)域。研究者將這種形態(tài)和侵襲性的變化與特定的轉(zhuǎn)錄譜聯(lián)系起來(lái)。他們從大量RNA-seq中鑒定出不同形態(tài)類(lèi)型之間差異表達(dá)的基因，并使用這些基因集從FateMap中將形態(tài)學(xué)映射到單細(xì)胞簇。因此，克隆間基因表達(dá)的差異對(duì)應(yīng)著在增殖、形態(tài)和侵襲性方面的功能差異。

圖2 克隆間基因表達(dá)的差異對(duì)應(yīng)于形態(tài)、增殖和侵襲性的差異

3、不同的耐藥類(lèi)型在癌癥中發(fā)生

研究者在其他癌細(xì)胞系中尋找耐藥類(lèi)型的多樣性。另一個(gè)患者來(lái)源的單細(xì)胞黑色素瘤細(xì)胞系(BRAFV600E WM983B E9-C6)也在維莫拉非尼治療下顯示了耐藥克隆之間的形態(tài)和增殖差異。FateMap揭示了WM989 A6-G3細(xì)胞中許多相同的轉(zhuǎn)錄特征和增殖差異(補(bǔ)充數(shù)據(jù))。

4、耐藥類(lèi)型出現(xiàn)在患者身上

研究者質(zhì)疑這些耐藥類(lèi)型是否也出現(xiàn)在患者身上，其中微環(huán)境(包括免疫系統(tǒng))和空間背景是因素。他們從4名在靶向治療后復(fù)發(fā)的患者身上獲得了腫瘤組織樣本。對(duì)于其中兩個(gè)人，他們也有他們接受治療前的匹配腫瘤樣本。對(duì)腫瘤進(jìn)行多次穿孔活檢。他們使用GeoMx DSP，從每次穿孔活檢中選擇由73到1,390個(gè)細(xì)胞組成的多個(gè)感興趣區(qū)(ROI)，并通過(guò)RNA-seq進(jìn)行圖譜分析(所有樣本中有93個(gè)區(qū)域)。結(jié)果顯示，關(guān)鍵耐藥類(lèi)型標(biāo)記物在耐藥腫瘤貼片中的表達(dá)存在廣泛的差異性，這表明患者體內(nèi)同一腫瘤的不同區(qū)域可能含有不同比例的FateMap。在接受靶向治療之前，他們?cè)诨颊咂ヅ涞哪[瘤樣本的鄰近區(qū)域發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的預(yù)先存在的可變性，這表明存在一定程度的預(yù)先存在的異質(zhì)性。此外，他們發(fā)現(xiàn)靶向治療后免疫浸潤(rùn)的異質(zhì)性。總之，這些結(jié)果為患者樣本中存在多種耐藥類(lèi)型提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。

圖3 空間轉(zhuǎn)錄組分析證實(shí)，患者在靶向治療后出現(xiàn)耐藥命運(yùn)類(lèi)型

5、由初始條件預(yù)先決定的抵抗命運(yùn)

研究者質(zhì)疑耐藥克隆的轉(zhuǎn)錄和表型變異是否是藥物暴露前細(xì)胞分子表達(dá)狀態(tài)的內(nèi)在差異的結(jié)果。或者，抗性類(lèi)型可以由外部決定。“同卵雙胞胎”分析與FateMap相結(jié)合，使他們能夠區(qū)分這些可能性。簡(jiǎn)而言之，在獨(dú)特的條形碼細(xì)胞上，讓它們分裂幾次，然后將群體分成兩個(gè)相等的分裂群體 A 和 B，這樣大多數(shù)帶有條形碼的克?。ǔ^(guò) 90%）作為“雙胞胎”存在于每組中。然后他們應(yīng)用維莫非尼并對(duì)兩個(gè)分割群體進(jìn)行 FateMap。如果細(xì)胞的抗性類(lèi)型是本質(zhì)上決定的，那么它的雙胞胎將共享相同的類(lèi)型。基因組 DNA (gDNA) 的純條形碼測(cè)序證實(shí)了群體之間條形碼的強(qiáng)烈重疊，表明耐藥潛力總體上是本質(zhì)上決定的。

接下來(lái)，他們測(cè)試了克隆所采用的特定抗性類(lèi)型是否類(lèi)似地由預(yù)抗性細(xì)胞的初始狀態(tài)而不是外部因素預(yù)先確定。結(jié)果顯示，雙胞胎具有相似的轉(zhuǎn)錄譜。研究者也制定了一個(gè)稱(chēng)為“混合系數(shù)”的指標(biāo)（方法）表明，采用不同的轉(zhuǎn)錄和表型類(lèi)型是由藥物暴露前細(xì)胞的內(nèi)在分子狀態(tài)決定的，環(huán)境因素對(duì)類(lèi)型結(jié)果幾乎沒(méi)有影響。

圖4 細(xì)胞在接受治療后注定會(huì)有不同的耐藥性

6、改變藥物劑量導(dǎo)致命運(yùn)轉(zhuǎn)換

耐藥性在很大程度上取決于所用藥物的濃度。研究者探索了如果使用 FateMap 在兩個(gè)分裂群體中使用不同的藥物濃度（每個(gè)群體都接受不同濃度的藥物），耐藥類(lèi)型的整體會(huì)如何變化。在低劑量治療的小鼠中，耐藥腫瘤生長(zhǎng)相對(duì)較快。FateMap 可以通過(guò)在條形碼后分割群體并將雙胞胎中的一個(gè)置于低劑量環(huán)境中，將另一個(gè)置于高劑量環(huán)境中來(lái)區(qū)分這些可能性。接下來(lái)他們探討了抗性克隆的多樣性在低劑量和高劑量藥物之間如何變化。盡管低劑量和高劑量之間的耐藥頻率存在廣泛變化，但兩個(gè)劑量之間的許多轉(zhuǎn)錄類(lèi)型是相同的。然而，也存在許多差異。

圖5 改變治療劑量會(huì)導(dǎo)致刻板的耐藥命運(yùn)類(lèi)型轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)錄譜的改變

03 研究結(jié)論

研究者專(zhuān)注于表征單細(xì)胞來(lái)源的癌細(xì)胞對(duì)抗癌療法的耐藥類(lèi)型。細(xì)胞系分析顯示即使在克隆系中也存在令人驚訝的變異性，這可能反映了克隆記憶。值得注意的是，這種變異性可以驅(qū)動(dòng)許多癌癥表型，包括治療耐藥性、生長(zhǎng)、致瘤性和轉(zhuǎn)移。FateMap 可以揭示多種生物過(guò)程中新興類(lèi)型的多樣性，包括干細(xì)胞重編程和定向分化，并識(shí)別它們的潛在起源。

審核編輯：劉清