病毒性疾病的傳播具有高度不穩(wěn)定性和高度傳染性。作為病毒傳播的載體，細(xì)胞是探索病毒傳播機(jī)制和疾病的重要因素。然而，目前仍然缺乏有效的手段來(lái)連續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞中病毒感染的過(guò)程，也沒(méi)有快速、高通量的方法來(lái)評(píng)估病毒感染的狀態(tài)。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近期，江蘇大學(xué)楊寧和哈佛大學(xué)張興才共同通訊（李桐歌為第一作者）在Science Advances期刊上在線發(fā)表題為“Virus detection light diffraction fingerprints for biological applications”的研究論文，研究成果被選為該期封面。該研究應(yīng)用了灰度共生矩陣，有效地設(shè)置了兩個(gè)參數(shù)來(lái)區(qū)分細(xì)胞的病毒感染狀態(tài)和感染時(shí)間，并將細(xì)胞的病毒感染過(guò)程可視化。該研究為在細(xì)胞水平上選擇優(yōu)良的家畜和家禽品種提供了一種高效且無(wú)損的測(cè)試方法。同時(shí)，該研究為隱性傳播的人傳人、動(dòng)物傳動(dòng)物和人畜共患病的檢測(cè)提供了方法，并且抑制和阻斷它們的進(jìn)一步發(fā)展。

基于無(wú)透鏡衍射的細(xì)胞病毒感染在線定位檢測(cè)系統(tǒng)的原理與結(jié)構(gòu)

鑒于病毒性疾病的動(dòng)物源性，病毒性疾病的檢測(cè)不僅局限于人類。監(jiān)測(cè)家畜或常見(jiàn)寵物如狗和貓等動(dòng)物也很重要，因?yàn)槿祟惻c動(dòng)物之間的密切接觸很容易傳播病毒。全球范圍內(nèi)大量報(bào)道的寵物感染嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）的證據(jù)表明，動(dòng)物在攜帶或傳播傳染性病毒方面具有一定的影響力。通過(guò)揭示與病毒侵入相關(guān)的細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，可以及時(shí)檢測(cè)和阻止病毒的跨物種傳播或溢出。

然而，傳統(tǒng)的體外檢測(cè)病毒應(yīng)激程度的方法周期長(zhǎng)，試劑種類繁多，并且難以自動(dòng)化處理，這在檢測(cè)后會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損害。 目前，常用的儀器檢測(cè)方法受到檢測(cè)手段的缺陷限制，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)特定細(xì)胞樣本的信息提取。因此，實(shí)時(shí)方法為控制和預(yù)防病毒性疾病的傳播提供了簡(jiǎn)便的研究思路。由于技術(shù)障礙，臨床檢測(cè)病毒性疾病需要大量時(shí)間和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析和測(cè)試，導(dǎo)致檢測(cè)到的目標(biāo)病毒范圍小或生成的二進(jìn)制信息質(zhì)量相對(duì)較低。因此，基于細(xì)胞水平的病毒學(xué)研究不僅可以優(yōu)化檢測(cè)過(guò)程，而且可以從本質(zhì)上揭示感染過(guò)程并探索病毒抑制方法。

傳統(tǒng)的病毒應(yīng)激細(xì)胞狀態(tài)檢測(cè)方法可分為標(biāo)記方法和非標(biāo)記方法。主要的標(biāo)記方法包括甲基噻唑啉偏二甲苯磺酸鹽（MTT）、2,3-雙-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑-5-羧酰胺（XTT）和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）測(cè)試，其原理是區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞并計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，一方面檢測(cè)與細(xì)胞健康狀態(tài)密切相關(guān)的細(xì)胞中的某些物質(zhì)，另一方面，由于標(biāo)記對(duì)細(xì)胞的侵害，無(wú)法在長(zhǎng)周期內(nèi)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)的多個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，因此沿著這一趨勢(shì)發(fā)展出了新的細(xì)胞活動(dòng)檢測(cè)方法。

由于傳輸光的相位分布與細(xì)胞體形態(tài)密切相關(guān)，因此Schmitz等人提出通過(guò)顯微成像和RNA篩選來(lái)測(cè)量細(xì)胞活動(dòng)，并提取所測(cè)量對(duì)象的相關(guān)信息。然而，顯微成像技術(shù)的視野較小，難以滿足高通量的細(xì)胞樣本成像和信息提取需求。此外，電或電化學(xué)信號(hào)需要特殊的電極來(lái)建立適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)環(huán)境，研究成本高，對(duì)電極性能有要求。這時(shí)，基于光譜學(xué)的無(wú)損檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)進(jìn)一步凸顯。

無(wú)透鏡全息技術(shù)打破了傳統(tǒng)顯微鏡的缺陷，并提供了既具有高分辨率又具有寬視野的顯微成像技術(shù)，能夠滿足細(xì)胞活動(dòng)評(píng)估的高通量需求。其成像區(qū)域可擴(kuò)展數(shù)百倍，為適應(yīng)不同樣本和應(yīng)用場(chǎng)景的需求提供了更大的靈活性。 基于以上研究成果，研究人員開(kāi)發(fā)了基于連續(xù)和高通量細(xì)胞的病毒光散射指紋的生物應(yīng)用，用于病毒檢測(cè)，可應(yīng)用于人類、寵物和家畜的病毒性疾病檢測(cè)，以及在細(xì)胞水平上選擇和繁育優(yōu)良的家畜和家禽品種。另一方面，它還可以及時(shí)檢測(cè)和抑制人與人、動(dòng)物與動(dòng)物以及人畜共患病的隱藏傳播，并阻止其進(jìn)一步發(fā)展。

圖2 不同形態(tài)細(xì)胞的衍射指紋分析 一個(gè)例子是，通過(guò)拍攝病毒應(yīng)激細(xì)胞的光散射光譜，利用無(wú)透鏡大場(chǎng)衍射成像平臺(tái)獲取了病毒應(yīng)激細(xì)胞的衍射指紋，將指紋信息量化以篩選高度耐受的細(xì)胞。首先，根據(jù)感染病毒的細(xì)胞形態(tài)的變化，探索了對(duì)光學(xué)路徑的影響。具有不同形態(tài)的細(xì)胞的衍射指紋在一定程度上是不同的。其次，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種有效反映細(xì)胞病毒應(yīng)激程度的指紋特征。此外，研究人員通過(guò)使用灰度共生矩陣（GLCM）定義的兩個(gè)參數(shù)，對(duì)指紋特征進(jìn)行量化。最后，開(kāi)發(fā)了基于無(wú)透鏡衍射的病毒應(yīng)激細(xì)胞的在線定位檢測(cè)系統(tǒng)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了聚類。利用豬睪丸細(xì)胞系（ST）和豬假性狂犬病病毒（PRV）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)，將其與其他衍射指紋量化方法進(jìn)行了比較，并使用MTT方法驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3 灰色共現(xiàn)矩陣分析了病毒感染不同時(shí)期的衍射指紋圖譜

圖4 衍射指紋圖譜的聚類結(jié)果和比較分析

與許多當(dāng)前病毒檢測(cè)方法相比，該研究提出的方法是一種光譜學(xué)無(wú)損測(cè)試，不需要化學(xué)試劑且不具破壞性。該研究實(shí)現(xiàn)了對(duì)某一細(xì)胞感染病毒的定位檢測(cè)，同時(shí)可以同時(shí)檢測(cè)許多其他細(xì)胞。本文中設(shè)置的分析參數(shù)首次進(jìn)行了系統(tǒng)研究，可以實(shí)現(xiàn)更好的分類效果。

審核編輯：黃飛