從實驗室到生產線

固態光源技術在生物成像與工業檢測中的性能提升

生物醫學成像和工業檢測的照明系統規格通常集中在光譜、空間和時間的光輸出特性上。Lumencor的技術支持總監Iain Johnson和我們分享了固態光源陣列——LED、發光管和激光器組合成的固態光引擎如何實現規格定制，以滿足特定應用的照明要求。

固態光引擎是一個集中控制的固態光源陣列，其輸出合并到一個共同的光學傳輸系統中（圖1）。光源的輸出可以并行激活以產生白光（圖2），或在需要分離的波長時，也可按順序進行激活（圖3、圖4）。光源本身可以采用一種固態照明技術，即LED、光導管或半導體激光器，也可以對這些光源技術進行組合。這可以根據最終用戶的應用對亮度、角度分布和輻照度的要求進行定制。根據這一定義，光引擎輸出的光譜分布可以通過加法組合，而這與傳統的寬光譜照明設備（電弧放電和白熾燈）形成鮮明對比。傳統的照明設備產生的光譜分布在物理上是不變的，只能通過選擇性的阻擋和衰減來調整。從工程學的角度來看，固態光源的第二個主要優點是，它的輸出可以在強度（圖2、圖4）和時間（圖4、圖5）方面進行精確控制。因此，光譜輸出單元件的差異很?。▓D2），這使得光引擎應用于不同成像系統時，所獲得的數據質量能保持一致。

圖1.固態光引擎及其輸出光譜的概念圖。四個固態光源的輸出被合并入一個共同的光路，并通過光導耦合進入纖維及或者圖像掃描儀。在實際操作中，光源可以是2-21個，具體數量取決于應用要求。光源可以是LED、光導管或半導體激光器其中的一種或組合。它們的輸出可以經過濾波（F）以細化光譜。輸出光的一部分會被分離出來，并導向參考光電二極管（rPD），以提供控制反饋。

在大多數生物醫學成像應用中，不需要持續照明，甚至在某些情況下，會起到反效果，影響實驗數據。通常情況下，照明與相機曝光會同步進行。這里有兩個重點：首先是光源間的切換速度，其次是脈沖間隔的復現性。相比和機械濾光輪耦合的白光照明器（約50ms的切換時間），光引擎可以做到小于1ms的光源間切換（圖4），縮短了獲取多色圖像Z軸堆疊或者玻片掃描所需的時間。脈沖間的積分不變形（圖5）是決定延時圖像序列保真度的關鍵因素。每個脈沖的積分量化了在延時序列中每次曝光所需的照度。脈沖之間的照度差異越小，樣品動態行為的敏感度就越能增加，這在圖像幀到幀的變化間可以體現。

圖2.28臺SOLA V-nIR光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）的光譜輸出曲線疊加。光引擎的總光輸出由光譜曲線所包圍的區域來量化。所有28臺光引擎的平均輸出功率為4558mW，標準差（n=28）為91mW，相當于2%的方差系數（CV）。

圖3.SPECTRA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）的光譜輸出，包括LED、發光管或激光器。發光二極管和光導管的波長規格（nm）代表了中心波長（CWL）/半高全寬（FWHM），已經通過內置的濾光片來改進光源輸出。功率（mW）是在光導（連接到顯微鏡或光學掃描儀）的遠端測量得到的。集成三種不同類型的固態光源，可以在整個可見光和近紅外波段內提供均勻的功率輸出。

圖4.由TTL觸發，AURA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）交替輸出485nm（約0.5ms寬）和560nm（約3ms寬）的脈沖（示波器記錄）。圖中顯示了兩條疊加的示波器軌跡，其中485nm的強度通過RS232串行命令從100%調整到55%，而560nm的強度保持不變。485nm和560nm的脈沖時間間隔為0.25ms。

圖5.模擬光電二極管（APD）檢測來自一臺5光源的AURA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）發出的5ms光脈沖。圖中展示了10個脈沖序列，代表了每次數據采集中記錄的150個連續脈沖。計算了150個脈沖序列中每個脈沖的積分光輸出。對于555/28 nm輸出，150個脈沖的方差系數（CV）在555/28 nm脈沖串中為0.23%，在635/22 nm脈沖序列中為0.20%。其他三個源通道的CV值相似（0.15-0.25%）。

除了光譜帶寬（圖3）以外，固態LED、光導管和激光器之間的主要區別在于其光輸出的角度分布；LED和激光器之前的最大區別如表1所示。對于寬場顯微鏡應用，LED光源配置為科勒照明產生的均勻照明，輻照度范圍為1-100mW/mm2。然而，單分子定位顯微鏡（SMLM）需要更高的輻照度，通過鏈接到顯微鏡臨界落射照明器（critical epilluminator）的CELESTA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR），可以在樣品表明提供10^4mW/mm2的輻照度（圖6）。臨界照明的使用是由科勒照明在光學上的低效率所決定的，因為科勒照明并沒有覆蓋整個光源表面或者發射光的全部角度分布。在臨界照明中，光源被直接成像到樣品平面上，這種方法更為高效，但對光源輸出中的任何空間不均勻性也更為敏感。臨界落射照明器的作用是均勻化任何空間上的不均勻性，以產生與典型sCMOS相機傳感器尺寸（~200mm2）相匹配的高輻照度照明場。

①輸出功率是在指定光導的遠端測量的

②使用光導將光源輸出耦合到顯微鏡或光學掃描儀

③光導的數值孔徑

④光通量積決定了光學檢測系統有效利用光源輸出的能力。當光源的光通量積與光學系統的光通量積緊密匹配時，可以獲得最佳性能。sr=球面弧度。

針對光驅動生物技術以及工業應用，優化光源的選擇性需要全面考慮儀器的光譜、空間和時間要求，這些正是需要照明光源來支持的。通常一種技術盡可以滿足其中的部分要求，所以最佳策略即是混合多種技術來滿足全部需求。復雜的光引擎可以提供這樣一種集成的方法來混合光源，并克服任何給定技術的基本限制，例如，在熒光分析中，LED在500-600nm的光中由于臭名昭著的“綠色間隙”功率和亮度往往無法滿足；或者相對于毫秒級的切換時間，任何弧光燈的開/關不穩定性；又或者廣譜光源進行多路復用研究時，譜寬也帶來了限制。如今各種固態光源各有優劣，只有仔細評估它們的優點與局限性，才能為光驅動生命和材料科學應用的廣泛領域找到最合適的照面解決方案。

圖6.使用CELESTA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR），通過一根直徑800um的光纖耦合到安裝在尼康Ti/Ti2顯微鏡的臨界落射照明器上，并產生均勻的熒光玻璃成像。使用尼康60/1.4 NA Plan Apo物鏡和Andor的 Zyla 5.5 (2560 x 2160 pixels) sCMOS相機進行圖像捕捉。圖表顯示了相機沿著標記為紅色的對角線所記錄的灰度值。右上角的插圖展示了使用尼康10X/0.3 NA Plan Apo物鏡成像的同一樣品。