許多光學(xué)顯微鏡應(yīng)用，特別是涉及熒光成像的應(yīng)用，需要波長辨別，要么過濾寬帶照明源，要么過濾到達(dá)相機(jī)的圖像，或者兩者兼而有之。用于波長過濾的傳統(tǒng)工具，如AOTF單色儀和濾光輪，都有不同程度的限制，這通常會(huì)影響它們在顯微鏡中的使用。

虹科柔性波長選擇器（FWS）是一種新型波長濾波設(shè)備，為照明和圖像濾波提供了優(yōu)勢的組合。具體地說，虹科FWS器件將單色器的波長可調(diào)諧性和帶寬控制與濾光輪的圓形均勻孔徑相結(jié)合，這些設(shè)備具有緊湊、操作簡單和明顯成本效益的優(yōu)點(diǎn)。在這篇文章中，我們描述了這項(xiàng)新的專利技術(shù)，并討論了它在顯微鏡方面的優(yōu)勢。

圖像濾波與光譜成像

熒光探針的標(biāo)測是基于波長選擇性成像，源波長與目標(biāo)熒光團(tuán)的吸收峰匹配以獲得最佳激發(fā)。在同一實(shí)驗(yàn)中使用多個(gè)熒光團(tuán)的情況下，使用兩個(gè)不同的波長可以選擇性地激發(fā)每個(gè)熒光團(tuán)。以這種方式，可以在包括來自激發(fā)源的散射和其他波長的熒光的背景下以最大信噪比選擇性地觀察來自每個(gè)熒光團(tuán)的斯托克斯位移熒光。

波長選擇性和可調(diào)諧性在其他類型的光學(xué)顯微鏡中也是有用的，例如用于對沒有內(nèi)源性熒光或添加熒光團(tuán)的透明樣品成像的相位對比度和傾斜照明方法。這里眾所周知，迭代地改變（調(diào)整）照明條件，特別是波長，可以選擇性地優(yōu)化圖像場內(nèi)不同目標(biāo)的對比度。

不同濾波技術(shù)的限制

（1）濾波器

在顯微鏡的檢測部分，濾光片和二向色分束器是在相機(jī)或目鏡之前進(jìn)行波長濾波的常用手段。這些濾波器可以與寬帶光源一起使用，用于波長選擇性照明，而不是LED或激光器。濾波器通常基于薄膜電介質(zhì)，有時(shí)結(jié)合彩色玻璃用于額外的波長阻擋。對于單個(gè)熒光團(tuán)，通常在相機(jī)之前使用帶通或截止濾波器。對于兩個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)，可以使用二向色電介質(zhì)分束器根據(jù)波長將光分成兩個(gè)相機(jī)，或者熒光團(tuán)可以使用單個(gè)相機(jī)前面的濾光輪交替成像。

濾波器和濾波器輪的局限性在于它們?nèi)狈`活性，因?yàn)槊總€(gè)濾波器的帶通波長和中心波長是固定的。因此，圖像不能作為波長的函數(shù)進(jìn)行掃描，也不能迭代地調(diào)整波長和帶寬以找到特定樣本的最佳（例如，高對比度）觀看條件。

（2）單色儀

單色儀基于衍射光柵或色散棱鏡對光源輸出進(jìn)行選擇。為了過濾光源，輸出狹縫或光纖僅用于選擇目標(biāo)波長窗口，通過旋轉(zhuǎn)光柵（或棱鏡）角度來連續(xù)地調(diào)諧該頻帶的中心。通過調(diào)節(jié)輸入和輸出狹縫的寬度，也可以平滑地改變透射光的帶寬。然而，在圖像檢測過程中并不常用單色器。原因是相機(jī)陣列的只有一個(gè)軸可以用于成像，另一個(gè)軸用于波長色散。因此，圖像必須單行或單像素進(jìn)行構(gòu)建。

（3）聲光可調(diào)諧濾波器（AOTF）

AOTF是基于將射頻（RF）輸入施加到諸如二氧化碲（TeO2）之類的奇異晶體的固態(tài)組件，由此產(chǎn)生的聲學(xué)振動(dòng)起到移動(dòng)衍射光柵的作用。AOTF的主要優(yōu)點(diǎn)是切換時(shí)間快，可以同時(shí)控制多個(gè)輸出。然而，它是一個(gè)復(fù)雜的射頻供電系統(tǒng)，成本相對較高。AOTF也具有較差的帶外消光。

虹科FWS-新型濾波技術(shù)

虹科FWS將其中兩個(gè)寬帶帶通濾波器組合在一個(gè)緊湊、不透光的外殼中。這種設(shè)計(jì)使得每個(gè)濾波器的入射角能夠獨(dú)立旋轉(zhuǎn)。虹科FWS提供了具有濾波器的大凈孔徑的單色儀的波長靈活性和精度，高帶外消光以及幾乎不受溫度或濕度變化影響的性能。此外，它簡單、經(jīng)濟(jì)、堅(jiān)固，可以作為顯微鏡的小型設(shè)備進(jìn)行封裝。

虹科FWS產(chǎn)品的帶寬可以從大約1.5納米調(diào)整到20納米（標(biāo)稱），并且，中心波長可以從大多數(shù)可見波長（350 nm–900 nm）中選擇。由于它們需要準(zhǔn)直光，顯微鏡中的無限空間（即，在相機(jī)之前）是基于該技術(shù)的緊湊型設(shè)備的理想位置。此外，準(zhǔn)直輸入/輸出允許簡單的光纖耦合，簡化集成。這些特性使其成為相機(jī)和顯微鏡光源中光譜濾波的理想選擇。

虹科波長選擇器的TwinFilm專利技術(shù)

如下圖所示，可以將虹科FWS用于激發(fā)和發(fā)射。對于激發(fā)，有必要選擇最佳波長以獲得最大效率，并避免多熒光團(tuán)實(shí)驗(yàn)中的交叉激發(fā)。對于發(fā)射，可以掃描整個(gè)波長范圍以進(jìn)行光譜成像。

對于多重標(biāo)記的多色熒光成像非常有用。在用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記細(xì)胞的不同部分后，可以使用虹科波長選擇器進(jìn)行同時(shí)成像。下圖顯示了分別標(biāo)記有DAPI（細(xì)胞核）、CMFDA綠（胞漿）和線粒體深紅色FM（線粒體）的固定HeLa細(xì)胞的熒光圖像。無需三種濾波器組或單色儀耗時(shí)掃描，可使用虹科FWS多邊形同時(shí)進(jìn)行三色成像。

使用不同染色劑標(biāo)定的HeLa細(xì)胞的熒光圖像

虹科波長選擇器的優(yōu)異性能，使其具有廣泛的應(yīng)用范圍和巨大的市場前景，可代替單色儀、AOTF等用于熒光顯微鏡、高光譜成像、生命科學(xué)儀器、機(jī)器視覺、實(shí)驗(yàn)室研究、光源檢測、高光譜成像等多個(gè)領(lǐng)域。

審核編輯 黃宇